Summary
Dieses Protokoll stellt einen optimierten Ansatz zur Herstellung genetisch veränderter Rattenmodelle dar. Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) wird verwendet, um eine DNA-Reparaturvorlage zu liefern, und die Elektroporation wird verwendet, um CRISPR-Cas9-Reagenzien zu verabreichen, um den Genom-Editierungsprozess im 2-Zell-Embryo abzuschließen.
Abstract
Die Genom-Editing-Technologie wird häufig eingesetzt, um genetisch veränderte Tiere, einschließlich Ratten, zu züchten. Die zytoplasmatische oder pronukleäre Injektion von DNA-Reparaturschablonen und CRISPR-Cas-Reagenzien ist die häufigste Verabreichungsmethode in Embryonen. Diese Art der Mikromanipulation erfordert jedoch den Zugang zu spezialisierten Geräten, ist mühsam und erfordert ein gewisses Maß an technischem Geschick. Darüber hinaus führen Mikroinjektionstechniken aufgrund der mechanischen Belastung des Embryos oft zu einer geringeren Überlebensrate des Embryos. In diesem Protokoll haben wir eine optimierte Methode entwickelt, um große DNA-Reparaturschablonen zu liefern, die in Verbindung mit der CRISPR-Cas9-Genom-Editierung arbeiten, ohne dass eine Mikroinjektion erforderlich ist. Dieses Protokoll kombiniert die AAV-vermittelte DNA-Verabreichung von einzelsträngigen DNA-Spendervorlagen mit der Verabreichung von CRISPR-Cas9-Ribonukleoprotein (RNP) durch Elektroporation, um 2-Zell-Embryonen zu modifizieren. Mit dieser neuartigen Strategie haben wir erfolgreich gezielte Knock-in-Rattenmodelle hergestellt, die DNA-Sequenzen mit einer Größe von 1,2 bis 3,0 kb mit Wirkungsgraden zwischen 42 % und 90 % einfügen.
Introduction
Die Entwicklung von CRISPR-basierten Genom-Editierungswerkzeugen hat unsere Fähigkeit beschleunigt, neue und anspruchsvollere gentechnisch veränderte Rattenmodelle effizient zu erstellen. Single-guide-RNA wird zusammen mit Cas9-Nuklease kombiniert, um Ribonukleoprotein-Komplexe (RNP) zu bilden, die auf DNA-Sequenzen von Interesse innerhalb des Genoms abzielen und zu doppelsträngigen DNA-Brüchen führen. Da zelluläre DNA-Reparaturmechanismen fehleranfällig sind, werden während des Reparaturprozesses Insertionen und Deletionen (INDELs) eingeführt, die die Funktion eines Zielgens stören können. Wenn eine gewünschte modifizierte DNA-Sequenz (Reparatur-Matrize) zusammen mit Genom-Editing-Reagenzien verabreicht wird, erfolgt das Einfügen der Reparatur-Matrize in die Region, die den doppelsträngigen DNA-Bruch enthält, durch einen Prozess, der als homologiegesteuerte Reparatur (HDR) bezeichnet wird. Dies ist eine effektive Strategie zur Generierung von Tiermodellen mit gezielten DNA-Insertionen/-Substitutionen (Knock-Ins). Eine Einschränkung besteht darin, dass Knock-in-Sequenzen oft sehr groß sind, was nachweislich die Effizienz der Geneditierung verringert und somit die Generierung des gewünschten Modells erschwert1. Zu den Strategien zur Steigerung der Knock-in-Effizienz gehörten die Linearisierung von Reparaturschablonen für doppelsträngige DNA (dsDNA) und einzelsträngige DNA (ssDNA) sowie die chemische Modifikation von DNA-Reparaturschablonen 2,3,4. Darüber hinaus wurde die pronukleäre Mikroinjektion zusammen mit HDR-stimulierenden Verbindungen, die Anwendung von elektrischen Impulsen in Verbindung mit der Mikroinjektion und die zeitgesteuerte Mikroinjektion in 2-Zell-Embryonen versucht 5,6,7. Trotz des Erfolgs einiger dieser Ansätze bleibt der Einbau von DNA-Sequenzen, die größer als 1,0 kb sind, technisch anspruchsvoll.
Die Elektroporation, eine gängige Methode zum Einbringen von Reagenzien in kultivierte Zelllinien, bietet eine Alternative zur Mikroinjektion zur Verabreichung von CRISPR-Cas9-Komponenten in Embryonen. Die Elektroporation von Embryonen, die erstmals in Rattenembryonen8 nachgewiesen wurde, wurde seitdem erfolgreich als Verabreichungsmethode bei Mäusen 9,10,11,12,13, Schweinen 14,15 und anderen Tiermodellorganismen eingesetzt 16,17,18. Die Embryonen, die in dem Medium mit den CRISPR-Cas9-Reagenzien suspendiert sind, werden in eine Küvette oder auf einen Objektträger zwischen zwei Elektroden gegeben und direkten elektrischen Stromimpulsen ausgesetzt. Dadurch entstehen vorübergehende Öffnungen in der Zona pellucida und der Plasmamembran des Embryos, durch die die CRISPR-Cas9-Komponenten in die Embryonen gelangen. Typischerweise werden elektrische "Poring"-Impulse auf mittlerer Ebene verwendet, um die temporären Öffnungen zu erzeugen, gefolgt von elektrischen "Transferimpulsen" auf niedrigerer Ebene, die die Bewegung der negativ geladenen Genom-Editing-Komponenten erleichtern. Die Elektroporation von Embryonen ist effizient, hat einen hohen Durchsatz und ist einfach durchzuführen. Während sich die Elektroporation von Embryonen bei der Einführung kleiner (<200 bp) ssDNA-Reparaturschablonen als sehr erfolgreich erwiesen hat, gibt es nur wenige Berichte über eine erfolgreiche Elektroporation größerer (>1,0 kb) Reparaturschablonen13,19. Diese Größenbeschränkung stellt eine wesentliche Einschränkung der Embryo-Elektroporation für die Erzeugung von Knock-in-Tiermodellen dar, die große Insertionen erfordern.
Im Rahmen der Gentherapie werden Adeno-assoziierte Viren (AAVs) aufgrund ihrer effizienten In-vivo-Infektiosität sowohl von sich teilenden als auch von sich nicht teilenden Zellen, ihrer fehlenden Pathogenität und ihrer seltenen genomischen Integration seit langem als Vehikel für die Verabreichung von genetischem Material verwendet20,21. In jüngster Zeit wurden in weiteren Studien AAVs mit der CRISPR-Cas9-Technologie kombiniert, um DNA-Reparaturschablonen und CRISPR-Reagenzien einzuführen 22,23,24. Dieser Ansatz ermöglicht die Verabreichung größerer DNA-Reparaturschablonen, ohne dass Mikroinjektionstechniken erforderlich sind.
Der HDR-Signalweg ist in den späten S- und G2-Phasen des Zellzyklus aktiver25,26. In in vitro durchgeführten Studien wurden signifikante Steigerungen der Knock-in-Effizienz durch die Verabreichung von CRISPR-Cas9-RNPs und DNA-Reparatur-Templates in G2-synchronisierte Zellen oder durch die Beschränkung des Vorhandenseins des Cas9-Proteins auf späte S- und G2-Phasen unter Verwendung eines Cas9-Geminin-Fusionsproteins2 erreicht. Darüber hinaus gibt es ein wichtiges zygotisches Genomaktivierungsereignis (ZGA), das während der verlängerten G2-Phase des Embryos im 2-Zell-Stadium auftritt und mit einem offenen Chromatinzustand verbunden ist. Es wird spekuliert, dass dies den CRISPR-Cas9-RNPs und Reparaturvorlagen einen besseren Zugang zur genomischen DNA verschafft.
Unser Ziel war es, auf all diesen Beobachtungen aufzubauen, indem wir den AAV-Ansatz mit der Elektroporation von Embryonen kombinierten, um CRISPR-Cas9-RNPs im 2-Zell-Stadium der Embryonalentwicklung einzuführen. Diese Strategie nutzt die größere DNA-Reparatur-Template-Lieferkapazität von AAV, die technische Leichtigkeit der Elektroporation und den optimaleren 2-Zell-Zeitpunkt für die genomische Zugänglichkeit während der Embryonalentwicklung, um eine effiziente Methode für die gezielte Genmanipulation von DNA-Insertionen zu schaffen. Wie in diesem Protokoll hervorgehoben, ermöglicht unsere optimierte Methode die Herstellung von gezielten Knock-in-Rattenmodellen mit Insertionen von DNA-Sequenzen mit einer Größe von 1,2 bis 3,0 kb, ohne dass Mikroinjektionstechniken erforderlich sind.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Versuchsverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Missouri (ACUC-Protokoll #25580) genehmigt und gemäß den Richtlinien des Leitfadens für die Verwendung und Pflege von Labortieren durchgeführt.
1. AAV-vermittelte Lieferung von DNA-Reparaturschablonen
- Entwerfen Sie das DNA-Konstrukt so, dass es die gewünschte Knock-in-Sequenz zwischen zwei Homologiearmen enthält. Typische Homologie-Armlängen sind 300-500 bp lang. Stellen Sie sicher, dass das gesamte DNA-Reparatur-Template (Homologiearme + gewünschte Knock-in-Sequenz) von invertierten terminalen Wiederholungen (ITRs) flankiert wird, indem Sie in ein geeignetes Plasmid-Rückgrat klonieren und in rekombinantes ssAAV1 oder ssAAV6 (Serotypen 1 oder 6) verpacken.
HINWEIS: Wenn die sgRNA-Zielsequenz in der DNA-Reparaturvorlage vorhanden ist, ist es wichtig, stille Mutationen zu entwickeln, um diese Sequenz zu stören und so eine CRISPR-Cas9-vermittelte Editierung des korrekt anvisierten Allels zu verhindern.
VORSICHT: Rekombinante virale AAV-Vektoren sind nicht integrierend und als BSL-1 klassifiziert. Für das Pipettieren und die Handhabung von Embryonen, die dem Virus ausgesetzt waren, werden aseptische Standardtechniken verwendet. - Künstlich hergestelltes ssAAV1 oder ssAAV6 (verpackt mit DNA-Reparatur-Template) zu 30 μl KSOM-R-Medium27,28 bis zu einer Endkonzentration von 3 × 107 Genomkopien (GC)/μl unter Mineralöl in 35 mm Petrischale geben.
- Platzieren Sie Zygoten mit sichtbaren Vorkernen in das KSOM-R-Medium, das technisch hergestelltes ssAAV enthält.
HINWEIS: Bei Verwendung dieses Protokolls ist es nicht erforderlich, die Zona pellucida zu verdünnen, da die AAV-Serotypen 1 und 6 in der Lage sind, die DNA-Reparaturschablonen für eine effiziente Verabreichung von DNA-Reparaturschablonen leicht zu passieren. - Bei 37 °C mit 5 % CO2 und maximaler Luftfeuchtigkeit für 18-20 h inkubieren, um eine ausreichende Virustransduktion zu ermöglichen.
2. Vorbereitung der Elektroporation
- Am nächsten Tag wird eine Elektroporationsmischung mit 100 ng/μl sgRNA und 100 ng/μl Cas9-Protein, verdünnt in Opti-MEM-Medien in einem sterilen RNase-freien Röhrchen hergestellt. Vorsichtig mischen.
- 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die RNP-Bildung zu ermöglichen.
- Schalten Sie während der Inkubationszeit den Elektroporator ein und schließen Sie die Kabel an eine Glasschieberelektrode mit einem Abstand von 1,5 mm an.
- Stellen Sie die Elektroporationsparameter wie in Tabelle 1 beschrieben ein.
3. Elektroporation von 2-Zell-Embryonen
- Pipettieren Sie vorsichtig 5 μl der CRISPR-Elektroporationsmischung zwischen die beiden Elektroden auf dem Objektträger, wobei Sie darauf achten müssen, dass keine Luftblasen in die Lösung gelangen.
- Entfernen Sie den Embryo im 2-Zell-Stadium aus der AAV-Lösung. Bringen Sie Embryonen im 2-Zell-Stadium in die Mischung, ohne dass sie die Seiten der Elektroden berühren. Dies geschieht, um eine Lyse zu vermeiden.
- Drücken Sie die Ohm-Taste , um die Impedanz zu messen. Stellen Sie sicher, dass die Impedanz zwischen 0,100 und 0,300 kΩ liegt. Das Reaktionsvolumen ändert die Impedanz (Volumen hinzufügen, um die Impedanz zu verringern, und Volumen subtrahieren, um die Impedanz zu erhöhen).
- Drücken Sie auf Start. Der Vorgang dauert nur wenige Sekunden.
- Die Embryonen werden unmittelbar nach der Elektroporation entnommen und 3 Mal in frischen 30-μl-Tropfen KSOM-R-Medien gewaschen.
- Die Embryonen werden wieder in einen 37 °C warmen Inkubator mit 5 %CO2 und maximaler Luftfeuchtigkeit für die In-vitro-Kultur in 500 μl Tropfen KSOM-R-Medien unter Mineralöl gelegt. Alternativ können Embryonen chirurgisch auf eine 1,5 Tage postkoitum (dpc) pseudoschwangere weibliche Ratte übertragen werden, um lebende Nachkommen zu zeugen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der AAV-vermittelten DNA-Verabreichung und der 2-Zell-Embryo-Elektroporations-Pipeline für die CRISPR-Cas9-Genom-Editierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gemäß dem Protokoll gibt es eine effektive AAV-vermittelte Verabreichung der DNA-Reparaturvorlage, die eine hocheffiziente HDR ermöglicht, nachdem 2-Zell-Embryonen mit CRISPR-Cas9-RNPs elektroporiert wurden. Wie im Video gezeigt, führt ein erfolgreicher Elektroporationsprozess dazu, dass sich auf jeder Elektrode Blasen bilden (Abbildung 2C) und die Impedanz im Bereich von 0,100 und 0,300 kΩ bleibt. Nach der Elektroporation ist es nicht ungewöhnlich, dass die Embryonen anschwellen und den perivitellinen Raum innerhalb der Zona pellucida ausfüllen (Abbildung 3). Diese Schwellung sollte nach einigen Stunden in Kultur abklingen. Es ist auch nicht ungewöhnlich, dass ein kleiner Prozentsatz (bis zu 20 %) der zellulären Fusionsereignisse nach der Elektroporation von 2-Zell-Embryonen auftritt (Abbildung 3). Die Zellfusion kann möglicherweise durch eine sorgfältige Ausrichtung der horizontalen Achsen anstelle einer vertikalen Ausrichtung zwischen den Elektroden vermieden werden (Abbildung 2B). In der Regel verwerfen wir jedoch alle verschmolzenen Embryonen nach dem Elektroporationsprozess.
Unsere AAV-vermittelte DNA-Verabreichung mit 2-Zell-Embryonen CRISPR-Cas9 RNP-Elektroporationstechnik hat sich als hocheffektiv für die Generierung von Knock-in-Rattenmodellen mit gezielten Insertionen erwiesen. Als wir unsere Methode an Rattenembryonen testeten und kultivierte Blastozysten auf eine Insertion eines künstlich hergestellten kurzen künstlichen Introns mit loxP-Stellen untersuchten, stellten wir fest, dass über 60 % der Blastozysten das korrekt anvisierte Knock-in-Allel enthielten, basierend auf der Analyse der Next Generation Sequence (NGS) (Abbildung 4). Darüber hinaus testeten wir unsere Methode zur Herstellung lebender Knock-in-Ratten und entwarfen ein Projekt zur Entwicklung einer Cre-Rekombinase-kodierenden Sequenz, die auf die ATG-Startstelle des Ratten-Drd2-Gens abzielt. Die AAV-verpackte DNA-Spender-Vorlage bestand aus ITR-Sequenzen, die für die AAV-Verpackung erforderlich waren, einem 5'-Homologiearm (422 bp Länge), einer Cre-pA-Sequenz (1.339 bp Länge) und einem 3'-Homologiearm (477 bp lang) (Abbildung 5A). Von den 11 geborenen Nachkommen waren 10 mittels PCR-Analyse positiv für die korrekt eingefügte Cre-pA-Sequenz in die ATG-Startstelle von Ratte Drd2 (Abbildung 5B-D). Die gezielte Insertion wurde später durch eine DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir in 7 verschiedenen Projekten eine durchschnittliche Knock-in-Erfolgsrate von 76 % bei Gründertieren erreicht haben, die durch PCR-Analyse über Homologie-Armverbindungen und DNA-Sequenzverifizierung bestimmt wurde (Tabelle 2).
| Spannung [V] | Impulslänge [ms] | Impuls-Intervall [ms] | # der Pulse | Zerfallsrate [%] | Polarität | |
| Poring-Puls | 40 | 3.5 | 50 | 4 | 10 | + |
| Impuls übertragen | 5 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
Tabelle 1: Parameter der Elektroporation. Stellen Sie sicher, dass die Strombegrenzung während der Elektroporation eingeschaltet ist.
Abbildung 2: Elektroporationsprozess des 2-Zell-Embryos. (A) Objektträgerelektrode aus Glas. (B) Embryonen, die in CRISPR-Cas9-Genom-Editierungsreagenzien suspendiert und vor der Elektroporation in die Glasobjektträgerelektrode geladen wurden. (C) Luftblasenbildung auf jeder Elektrode während der Elektroporation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Erscheinungsbild des Embryos nach Elektroporation. Eine Zellfusion wird bei bis zu 20% der 2-Zell-Embryonen nach der Elektroporation festgestellt. Embryonale Zellen können auch innerhalb der Zona pellucida anschwellen und den perivitellinen Raum ausfüllen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: AAV-vermittelte DNA-Abgabe und 2-Zell-Embryo-Elektroporations-Knock-in-Effizienz in Kulturblastozysten von Ratten. Die Daten werden als Prozentsatz der Blastozysten dargestellt, die positiv für den korrekten Nachweis des Knock-in-Allels durch Next Generation Sequencing (NGS) sind. N=28 Blastozysten (Nur-Kultur-Kontrollgruppe), N=37 Blastozysten (nur Elektroporation (EP)-Kontrollgruppe) und N=35 Blastozysten (AAV+EP-Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Erstellung eines Drd2-Cre-Knock-in-Rattenmodells. (A) Targeting des Ratten-Drd2-Gens. Der RNP-Komplex wurde so konzipiert, dass er auf Exon 2 abzielt, das die Startstelle der kodierenden Region enthält. Das AAV-Donor-Template enthielt virale invertierte terminale Wiederholungssequenzen (ITR), 5'- und 3'-Drd2-Genhomologiearme (HA) und das Cre-Gen mit einer polyA-Sequenz. Die erfolgreiche Integration des Donor-Templates schlägt das Cre-Gen 3' an die Startstelle innerhalb von Exon 2 ein. Dadurch wird das Cre-Gen unter die Kontrolle des Drd2-Promotors gebracht, während gleichzeitig das Drd2-Gen ausgeschaltet wird. Die Position der PCR-Primer, die zur Bestätigung des erfolgreichen Knock-ins verwendet werden, ist durch violette Pfeile gekennzeichnet. (B) PCR-Analyse von potentiell genomeditierten Tieren (Lanes B10-C8) mit Primern, die sich über den 5'-Homologiearm erstrecken. Spur C9: Wildtyp (Negativkontrolle); Spur C10: keine Schablone (Negativkontrolle). Die erwartete Amplikongröße für Knock-in-positive Tiere beträgt 601 bp. (C) PCR-Analyse von potentiell genomeditierten Tieren (Lanes D8-E6) mit Primern, die sich über den 3'-Homologiearm erstrecken. Spur E7: Wildtyp; Spur E8: kein Template-Steuerelement. Die erwartete Amplikongröße für Knock-in-positive Tiere beträgt 676 bp. (D) Nachweis von Cre-Genen. Die erwartete Amplikongröße beträgt 381bp. Lanes C7-D5: potentielle Gründer; Spur D6: Wildtyp; Spur D7: kein Template-Steuerelement. Die PCR-Reaktionen wurden mittels Kapillarelektrophorese mit 15bp-3kb Alignment-Markern (grün markiert) analysiert. Der QX-DNA-Größenmarker ist links neben jedem Bild mit einer Peakgröße dargestellt, die der Größe des PCR-Amplikons in Basenpaaren (bp) entspricht. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Referenz24 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Projektbeschreibung | Nachkommen positiv für Knock-In (%) |
| Oprm1-P2A-Flp (1.7 kb Einfügung) | 5/5 (100%) |
| Drd2-Cre (1.3 kb Einfügung) | 10/11 (91%) |
| Triml2-P2A-Cre (1.3 kb Einfügung) | 9/16 (56%) |
| Cxcl15-iCre (1.3 kb Einfügung) | 6/6 (100%) |
| Opn4-P2A-Cre (1.2 kb Einfügung) | 6/8 (75%) |
| Vipr1-FLEX-EGFP (1.4 kb Einfügung) | 5/12 (42%) |
| Rosa26-FLEX-MTS-KillerRed (3.1 kb insertion) | 5/7 (71%) |
Tabelle 2: Erfolgsquoten des Knock-in-Modells
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Das Genom-Editing-System CRISPR-Cas hat die Gentechnik revolutioniert, indem es die effiziente Herstellung sowohl einfacher als auch komplexer, maßgeschneiderter genetischer Veränderungen in einer Vielzahl von Tierarten ermöglicht. Häufige Verfeinerungen und Verbesserungen der Techniken im Zusammenhang mit der Genom-Editierung erhöhen seine Vielseitigkeit. Hier haben wir einen neuen Ansatz beschrieben, der die ssAAV-vermittelte DNA-Verabreichung zusammen mit der Elektroporation von 2-Zell-Embryonen von CRISPR-Cas9-Reagenzien in 2-Zell-Nagetierembryonen verwendet. Wir haben gezeigt, dass dies ein effektiver Weg ist, um gezielte Knock-in-Tiermodelle herzustellen.
Ein großer Vorteil der Verwendung von AAV besteht darin, dass sie die Verabreichung größerer DNA-Reparaturschablonen in Embryonen ermöglicht, ohne dass Mikroinjektionstechniken erforderlich sind. Die AAV-vermittelte Verabreichung hilft auch, die Größenbeschränkungen der DNA-Matrizen bei der alleinigen Elektroporation zu umgehen. Bei der Verwendung von AAV gibt es jedoch einige wichtige Überlegungen. Die Zona pellucida, die gehärtete Glykoproteinmatrix, die die befruchtete Eizelle umgibt, dient als physikalische Barriere, die die Abgabe von Nukleinsäuren oft erschwert. Die Ausdünnung der Zona pellucida ist eine gängige Technik, die für einen besseren Zugang zum Embryo verwendet wird. Einige Studien haben jedoch berichtet, dass die Embryonalentwicklung durch eine Infektion mit höheren Dosen (1 ×10 7 GC/μL bis 1 × 109 GC/μL) AAV bei Embryonen, bei denen die Zona pellucida vor der AAV-Infektion ausgedünnt war, behindert wird22. Es gibt jedoch einige Serotypen von AAV, die über die Zona pellucida29 diffundieren können. Unser Protokoll beinhaltet keine Ausdünnung der Zona pellucida und verwendet AAV mit den Serotypen 1 und 6 in einer Konzentration von 3 ×10 7 GC/μl, um höhere Knock-in-Raten als zuvor veröffentlichte Berichte zu erzielen. Eine verminderte Embryonalentwicklung konnten wir unter diesen Bedingungen nicht feststellen.
Die hohe Knock-in-Effizienz, die durch die Elektroporation von 2-Zell-Embryonen erreicht wird, ist höchstwahrscheinlich auf die verlängerte G2-Phase in Embryonen in diesem Entwicklungsstadium zurückzuführen, was dies zu einem optimalen Entwicklungsstadium für die Durchführung der Elektroporation macht. Eine mögliche Komplikation ist jedoch die beobachtete Zellfusion, die bei einigen 2-Zell-Embryonen während des Elektroporationsprozesses beobachtet wurde. Diese Beobachtung ist nicht überraschend, wenn man bedenkt, dass Elektrofusionsverfahren üblicherweise zur Verschmelzung von Säugetierzellen verwendet werden und die Fusion möglicherweise durch sorgfältige horizontale statt vertikale Ausrichtung zwischen den Elektroden30,31 vermieden werden kann. Wenn die Genom-Editierung in einem späteren Entwicklungsstadium erfolgt, z. B. 2-Zell statt 1-Zelle, besteht außerdem ein größeres Potenzial für einen erhöhten Mosaizismus. Mit unserem 2-Zell-Elektroporationsansatz beobachteten wir einen leichten Anstieg des Mosaizismus im Vergleich zur pronukleären Injektion (86 % für den AAV-Ansatz und 67 % für den PNI-Ansatz) im 1-Zell-Stadium, konnten aber dennoch eine Keimbahnübertragung des modifizierten Allels bei allen getesteten Gründertieren erreichen. Ein weiteres potenzielles Problem ist die Möglichkeit der Tandem-Verkettungsintegration von AAV-abgeleiteten DNA-Templates. Während wir für die in diesem Protokoll beschriebenen Modelle keine Long-Read-Sequenzierung durchführten, bestätigten wir die Einzelintegration der DNA-Templates für alle Modelle unter Verwendung der Droplet-Digital-PCR (ddPCR)-Kopienzahlvariation.
Während unsere Methode die AAV-Verabreichung von DNA-Sequenzen von Interesse beinhaltete, sollte es möglich sein, andere virale und nicht-virale vermittelte DNA-Verabreichungsansätze in Verbindung mit der Elektroporation von Embryonen zu verwenden, um Embryonen erfolgreich genetisch zu manipulieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination von ssAAV-vermittelter DNA-Verabreichung und Elektroporation von CRISPR-Cas9-RNPs in Embryonen im 2-Zell-Stadium eine effiziente und leicht anpassbare Methode zur effizienten Generierung von Knock-in-Rattenmodellen ist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Nolan Davis für die Unterstützung bei der Videografie und Videobearbeitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
References
- Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20 (2020).
- Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).
- Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).
- Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR. Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67 (2020).
- Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos. Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).
- Kurihara, T., et al. DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons. Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci Rep. 4, 6382 (2014).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Troder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), e0196891 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Sci Rep. 8 (1), 474 (2018).
- Tanihara, F., et al. Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes. BMC Biotechnol. 20 (1), 40 (2020).
- Tanihara, F., et al. Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes. Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Front Genet. 11, 570069 (2020).
- Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes. Front Genet. 12, 648482 (2021).
- Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos. Data Brief. 21, 316-320 (2018).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing. Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).
- Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications. Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Davis, D. J., et al. Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation. Front Genome Ed. 5, 1256451 (2023).
- Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle. Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).
- Takata, M., et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro. Theriogenology. 198, 69-74 (2023).
- Romeo, C., et al. AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs. Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).
- Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells. Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).
- Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382 (2013).
