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Genetics

Édition du génome CRISPR-Cas9 d’embryons de rats à l’aide d’un virus adéno-associé (AAV) et d’une électroporation d’embryons à 2 cellules

Published: March 15, 2024 doi: 10.3791/66069
Automatic Translation
1,2,4, 2, 3, 3, 3, 1,2,3,4
1Animal Modeling Core, University of Missouri, 2Comparative Medicine Program, University of Missouri, 3Rat Resource and Research Center, University of Missouri, 4Department of Veterinary Pathobiology, University of Missouri

Summary

Ce protocole présente une approche optimisée pour la production de modèles de rats génétiquement modifiés. Le virus adéno-associé (AAV) est utilisé pour fournir une matrice de réparation de l’ADN, et l’électroporation est utilisée pour délivrer des réactifs CRISPR-Cas9 afin de compléter le processus d’édition du génome dans un embryon à 2 cellules.

Abstract

La technologie d’édition du génome est largement utilisée pour produire des animaux génétiquement modifiés, y compris des rats. L’injection cytoplasmique ou pronucléaire de matrices de réparation de l’ADN et de réactifs CRISPR-Cas est la méthode d’administration la plus courante dans les embryons. Cependant, ce type de micromanipulation nécessite l’accès à du matériel spécialisé, est laborieux et nécessite un certain niveau de compétence technique. De plus, les techniques de micro-injection entraînent souvent une survie embryonnaire plus faible en raison du stress mécanique subi par l’embryon. Dans ce protocole, nous avons développé une méthode optimisée pour fournir de grands modèles de réparation de l’ADN qui fonctionnent en conjonction avec l’édition du génome CRISPR-Cas9 sans avoir besoin de micro-injection. Ce protocole combine l’administration d’ADN médiée par AAV de modèles de donneurs d’ADN simple brin avec l’administration de la ribonucléoprotéine (RNP) CRISPR-Cas9 par électroporation pour modifier les embryons à 2 cellules. À l’aide de cette nouvelle stratégie, nous avons réussi à produire des modèles ciblés de rats knock-in portant l’insertion de séquences d’ADN d’une taille de 1,2 à 3,0 kb avec des efficacités comprises entre 42 % et 90 %.

Introduction

Le développement d’outils d’édition du génome basés sur CRISPR a accéléré notre capacité à générer efficacement de nouveaux modèles de rats génétiquement modifiés plus sophistiqués. L’ARN guide unique, ainsi que la nucléase Cas9, sont combinés pour former des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) qui ciblent les séquences d’ADN d’intérêt dans le génome et entraînent des cassures d’ADN double brin. Étant donné que les mécanismes de réparation de l’ADN cellulaire sont sujets aux erreurs, des insertions et des délétions (INDEL) sont introduites au cours du processus de réparation, ce qui peut perturber la fonction d’un gène cible. Lorsqu’il y a co-livraison d’une séquence d’ADN modifiée souhaitée (matrice de réparation) avec des réactifs d’édition du génome, l’insertion de la matrice de réparation dans la région contenant la cassure de l’ADN double brin se produit par un processus appelé réparation dirigée par homologie (HDR). Il s’agit d’une stratégie efficace pour générer des modèles animaux avec des insertions/substitutions d’ADN ciblées (knock-ins). L’une des limites est que les séquences knock-in sont souvent de grande taille, ce qui réduit l’efficacité de l’édition de gènes, ce qui rend la génération du modèle souhaité plus difficile1. Les stratégies visant à accroître l’efficacité de la frappe ont inclus la linéarisation des modèles de réparation de l’ADN double brin (ADNdb) et de l’ADN simple brin (ADNss) et la modification chimique des modèles de réparation de l’ADN 2,3,4. De plus, la micro-injection pronucléaire avec des composés stimulant le HDR, l’application d’impulsions électriques en conjonction avec la micro-injection et la micro-injection chronométrée dans des embryons à 2 cellules ont toutes été tentées 5,6,7. Malgré le succès de certaines de ces approches, l’incorporation de séquences d’ADN de plus de 1,0 kb reste techniquement difficile.

L’électroporation, qui est une méthode courante d’introduction de réactifs dans les lignées cellulaires en culture, offre une alternative à la micro-injection pour délivrer des composants CRISPR-Cas9 dans les embryons. L’électroporation embryonnaire, démontrée pour la première fois chez des embryons de rat8, a depuis été utilisée avec succès comme méthode d’administration chez les souris 9,10,11,12,13, les porcs 14,15 et d’autres organismes modèles animaux 16,17,18. Les embryons, en suspension dans le milieu contenant les réactifs CRISPR-Cas9, sont placés dans une cuvette ou sur une lame de verre entre deux électrodes et soumis à des impulsions directes de courants électriques. Cela crée des ouvertures transitoires dans la zone pellucide et la membrane plasmique de l’embryon à travers lesquelles les composants CRISPR-Cas9 pénètrent dans les embryons. En règle générale, des impulsions électriques de niveau intermédiaire sont utilisées pour créer les ouvertures temporaires, suivies d’impulsions de transfert électriques de niveau inférieur qui facilitent le mouvement des composants d’édition du génome chargés négativement. L’électroporation des embryons est efficace, a un débit élevé et est facile à réaliser. Cependant, alors que l’électroporation embryonnaire s’est avérée très efficace pour l’introduction de modèles de réparation d’ADNss de petite taille (<200 pb), il existe peu de rapports d’électroporation réussie de modèles de réparation plus grands (>1,0 kb)13,19. Cette restriction de taille représente une limitation majeure de l’électroporation embryonnaire pour la génération de modèles animaux knock-in nécessitant de grandes insertions.

Dans le contexte de la thérapie génique, les virus adéno-associés (AAV) ont longtemps été utilisés comme véhicules pour délivrer du matériel génétique en raison de leur infectiosité in vivo efficace des cellules en division et non en division, de leur manque de pathogénicité et de leur intégration génomique rare20,21. Récemment, d’autres études ont combiné les AAV avec la technologie CRISPR-Cas9 pour introduire des modèles de réparation de l’ADN et des réactifs CRISPR 22,23,24. Cette approche permet de fournir des modèles de réparation de l’ADN plus grands sans avoir besoin de techniques de micro-injection.

La voie HDR est plus active dans les phases tardives S et G2 du cycle cellulaire25,26. Dans les études réalisées in vitro, des augmentations significatives de l’efficacité de knock-in ont été obtenues par l’administration de RNP CRISPR-Cas9 et de matrices de réparation de l’ADN dans des cellules synchronisées G2 ou par la restriction de la présence de la protéine Cas9 aux phases tardives S et G2 à l’aide d’une protéine de fusion Cas9-Géminine2. De plus, il y a un événement majeur d’activation du génome zygotique (ZGA) qui se produit pendant la phase G2 prolongée de l’embryon au stade 2 cellules, et cela est associé à un état de chromatine ouvert. On suppose que cela donne aux RNP CRISPR-Cas9 et aux modèles de réparation une plus grande accessibilité à l’ADN génomique.

Notre objectif était de nous appuyer sur toutes ces observations, en combinant l’approche AAV avec l’électroporation de l’embryon pour introduire les RNP CRISPR-Cas9 au stade 2 cellules du développement embryonnaire. Cette stratégie tire parti de la plus grande capacité d’administration de la matrice de réparation de l’ADN de l’AAV, de la facilité technique de l’électroporation et du point de temps plus optimal à 2 cellules pour l’accessibilité génomique pendant le développement de l’embryon afin de créer une méthode efficace pour le génie génétique ciblé des insertions d’ADN. Comme le souligne ce protocole, notre méthode optimisée permet de produire des modèles ciblés de rats knock-in portant des insertions de séquences d’ADN d’une taille de 1,2 à 3,0 kb sans avoir besoin de techniques de micro-injection.

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Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Missouri (protocole ACUC #25580) et ont été effectuées conformément aux directives énoncées dans le Guide pour l’utilisation et le soin des animaux de laboratoire.

1. Livraison d’un modèle de réparation de l’ADN médié par l’AAV

  1. Concevez la construction de l’ADN pour qu’elle contienne la séquence de knock-in souhaitée entre deux bras d’homologie. Les longueurs de bras d’homologie typiques sont de 300 à 500 pb de longueur. S’assurer que l’ensemble de la matrice de réparation de l’ADN (bras d’homologie + séquence de knock-in souhaitée) est flanqué de répétitions terminales inversées (ITR) en clonant dans un squelette plasmidique approprié et en empaquetant dans des ssAAV1 ou ssAAV6 recombinants (sérotypes 1 ou 6).
    REMARQUE : Si la séquence cible de l’ARNsg est présente dans la matrice de réparation de l’ADN, il est important de concevoir des mutations silencieuses pour perturber cette séquence, empêchant ainsi l’édition médiée par CRISPR-Cas9 de l’allèle correctement ciblé.
    ATTENTION : Les vecteurs viraux AAV recombinants ne sont pas intégrateurs et sont classés comme BSL-1. Les techniques aseptiques standard sont utilisées pour le pipetage et la manipulation des embryons qui ont été exposés au virus.
  2. Ajouter du ssAAV1 ou du ssAAV6 (emballé avec un modèle de réparation de l’ADN) à 30 μL de milieu KSOM-R27,28 jusqu’à une concentration finale de 3 × 107 copies du génome (GC)/μL sous de l’huile minérale dans une boîte de Pétri de 35 mm.
  3. Placez les zygotes avec des pronoyaux visibles dans le milieu KSOM-R contenant du ssAAV modifié.
    REMARQUE : À l’aide de ce protocole, il n’est pas nécessaire d’éclaircir la zone pellucide, car les sérotypes AAV 1 et 6 peuvent facilement passer à travers pour une livraison efficace de la matrice de réparation de l’ADN.
  4. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 et une humidité maximale pendant 18 à 20 h pour permettre une transduction virale suffisante.

2. Préparation de l’électroporation

  1. Le lendemain, préparez un mélange d’électroporation contenant 100 ng/μL d’ARNsg et 100 ng/μL de protéine Cas9 dilué dans un milieu Opti-MEM dans un tube stérile sans RNase. Mélangez délicatement.
  2. Incuber à température ambiante pendant 10 min pour permettre la formation de RNP.
  3. Pendant le temps d’incubation, allumez l’électroporateur et connectez les fils à une électrode coulissante en verre de 1,5 mm.
  4. Définissez les paramètres d’électroporation comme décrit dans le tableau 1.

3. Électroporation embryonnaire à 2 cellules

  1. Pipeter doucement 5 μL du mélange d’électroporation CRISPR entre les deux électrodes sur la lame de verre en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air dans la solution.
  2. Retirez l’embryon au stade 2 cellules de la solution AAV. Alignez les embryons au stade de 2 cellules dans le mélange sans leur permettre de toucher les côtés des électrodes. Ceci est fait pour éviter la lyse.
  3. Appuyez sur le bouton Ohm pour mesurer l’impédance. Assurez-vous que l’impédance est comprise entre 0,100 et 0,300 kΩ. Le volume de réaction modifiera l’impédance (ajouter du volume pour diminuer l’impédance et soustraire du volume pour augmenter l’impédance).
  4. Appuyez sur Démarrer. Le processus ne prend que quelques secondes.
  5. Prélever les embryons immédiatement après l’électroporation et les laver 3 fois dans des gouttes fraîches de 30 μL de milieu KSOM-R.
  6. Replacer les embryons dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 et une humidité maximale pour une culture in vitro dans 500 μL de milieux KSOM-R sous huile minérale. Alternativement, transférer chirurgicalement les embryons à un rat femelle pseudo-coït post-coït (dpc) de 1,5 jour pour produire une progéniture vivante.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de l’administration d’ADN médiée par l’AAV et du pipeline d’électroporation d’embryons à 2 cellules pour l’édition du génome CRISPR-Cas9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Representative Results

En suivant le protocole, il y a une administration efficace médiée par AAV du modèle de réparation de l’ADN, ce qui permet un HDR très efficace après que les embryons à 2 cellules aient été électroporés avec des RNP CRISPR-Cas9. Comme le montre la vidéo, un processus d’électroporation réussi entraîne la formation de bulles sur chaque électrode (Figure 2C) et l’impédance reste dans la plage de 0,100 à 0,300 kΩ. Après l’électroporation, il n’est pas rare que les embryons gonflent, remplissant l’espace périvitellin, à l’intérieur de la zone pellucide (Figure 3). Ce gonflement devrait s’atténuer après quelques heures de culture. Il n’est pas rare non plus de voir un faible pourcentage (jusqu’à 20 %) d’événements de fusion cellulaire après l’électroporation d’embryons à 2 cellules (Figure 3). La fusion cellulaire peut potentiellement être évitée par un alignement minutieux de l’axe horizontal plutôt que par un alignement vertical entre les électrodes (Figure 2B). Cependant, nous nous contentons généralement de jeter tous les embryons fusionnés après le processus d’électroporation.

Notre technique d’électroporation RNP CRISPR-Cas9 d’embryon à 2 cellules s’est avérée très efficace pour générer des modèles de rats knock-in avec des insertions ciblées. En testant notre méthode sur des embryons de rat et en criblant des blastocystes en culture pour l’insertion d’un intron artificiel court contenant des sites loxP, nous avons noté que plus de 60 % des blastocystes contenaient l’allèle knock-in correctement ciblé sur la base de l’analyse de la séquence de nouvelle génération (NGS) (Figure 4). De plus, en testant notre méthode pour produire des rats knock-in vivants, nous avons conçu un projet visant à concevoir une séquence codante pour la recombinase Cre ciblant le site de départ ATG du gène Drd2 du rat. La matrice du donneur d’ADN emballé dans l’AAV se composait de séquences ITR requises pour l’emballage de l’AAV, d’un bras d’homologie de 5' (longueur de 422 pb), d’une séquence Cre-pA (longueur de 1 339 pb) et d’un bras d’homologie de 3' (longueur de 477 pb) (Figure 5A). Sur les 11 enfants nés, 10 étaient positifs par analyse PCR pour la séquence Cre-pA correctement insérée dans le site de départ de l’ATG du rat Drd2 (Figure 5B-D). L’insertion ciblée a ensuite été confirmée par l’analyse de la séquence d’ADN. En résumé, sur 7 projets différents, nous avons atteint un taux de réussite moyen de 76 % chez les animaux fondateurs, tel que déterminé par l’analyse PCR à travers les jonctions du bras d’homologie et la vérification de la séquence d’ADN (tableau 2).

Tension [V] Longueur d’impulsion [ms] Intervalle d’impulsion [ms] # de légumineuses Taux de décroissance [%] Polarité
Pouls de pores 40 3.5 50 4 10 +
Impulsion de transfert 5 50 50 5 40 +/-

Tableau 1 : Paramètres d’électroporation. Assurez-vous que la limite de courant est activée pendant l’électroporation.

Figure 2
Figure 2 : Processus d’électroporation de l’embryon à 2 cellules. (A) Électrode à lame de verre. (B) Embryons suspendus dans des réactifs d’édition du génome CRISPR-Cas9 et chargés dans l’électrode à lame de verre avant l’électroporation. (C) Formation de bulles d’air sur chaque électrode pendant l’électroporation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Aspect de l’embryon après électroporation. La fusion cellulaire est observée chez jusqu’à 20% des embryons à 2 cellules après électroporation. Les cellules embryonnaires peuvent également gonfler à l’intérieur de la zone pellucide, remplissant l’espace périvitellin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Efficacité de l’administration de l’ADN médiée par l’AAV et de l’électroporation de l’embryon à 2 cellules dans des blastocystes de rat en culture. Les données sont présentées sous forme de pourcentage de blastocystes positifs pour la détection correcte de l’allèle knock-in par séquençage de nouvelle génération (NGS). N = 28 blastocystes (groupe témoin en culture uniquement), N = 37 blastocystes (groupe témoin par électroporation (EP) uniquement) et N = 35 blastocystes (groupe AAV + EP). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Création d’un modèle de rat knock-in Drd2-Cre. (A) Ciblage du gène Drd2 chez le rat. Le complexe RNP a été conçu pour cibler l’exon 2 qui contient le site de départ de la région codante. Le modèle du donneur AAV contenait des séquences virales de répétition terminale inversée (ITR), des bras d’homologie génique (HA) Drd2 5' et 3' et le gène Cre avec une séquence polyA. L’intégration réussie du modèle de donneur frappe dans le gène Cre 3' au site de départ au sein de l’exon 2. Cela place le gène Cre sous le contrôle du promoteur Drd2 tout en éliminant simultanément le gène Drd2. L’emplacement des amorces PCR utilisées pour confirmer la réussite du knock-in est indiqué par des flèches violettes. (B) Analyse par PCR d’animaux potentiellement modifiés par le génome (voies B10-C8) avec des amorces s’étendant sur le bras d’homologie 5'. Voie C9 : type sauvage (contrôle négatif) ; Voie C10 : pas de gabarit (contrôle négatif). La taille de l’amplicon attendue pour les animaux knock-in positifs est de 601 pb. (C) Analyse PCR d’animaux potentiellement modifiés par génome (Lanes D8-E6) avec des amorces s’étendant sur le bras d’homologie 3'. Voie E7 : type sauvage ; Voie E8 : pas de contrôle de modèle. La taille attendue de l’amplicon pour les animaux knock-in positifs est de 676 pb. (D) Détection du gène Cre. La taille attendue de l’amplicon est de 381 pb. Voies C7-D5 : fondateurs potentiels ; Voie D6 : type sauvage ; Voie D7 : pas de contrôle de gabarit. Les réactions PCR ont été analysées par électrophorèse capillaire avec des marqueurs d’alignement 15bp-3kb (indiqués en vert). Le marqueur de taille de l’ADN QX est affiché à gauche de chaque image avec la taille du pic correspondant à la taille de l’amplicon PCR en paires de bases (bp). Cette figure est modifiée avec l’autorisation de la référence24. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Description du projet Progéniture positive pour knock-in (%)
Oprm1-P2A-Flp (insertion de 1,7 ko) 5/5 (100%)
Drd2-Cre (insertion de 1,3 ko) 10/11 (91%)
Triml2-P2A-Cre (insertion de 1,3 ko) 9/16 (56%)
Cxcl15-iCre (insertion de 1,3 ko) 6/6 (100%)
Opn4-P2A-Cre (insertion de 1,2 ko) 6/8 (75%)
Vipr1-FLEX-EGFP (insertion de 1,4 ko) 5/12 (42%)
Rosa26-FLEX-MTS-KillerRed (3.1 ko d’insertion) 5/7 (71%)

Tableau 2 : Taux de réussite du modèle knock-in

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Discussion

Le système d’édition du génome CRISPR-Cas a révolutionné le domaine du génie génétique en permettant la production efficace de modifications génétiques personnalisées simples et complexes chez une variété d’espèces animales. Des raffinements et des améliorations fréquents dans les techniques associées à l’édition du génome renforcent sa polyvalence. Nous avons décrit ici une nouvelle approche utilisant l’administration d’ADN médiée par ssAAV ainsi que l’électroporation embryonnaire à 2 cellules de réactifs CRISPR-Cas9 dans des embryons de rongeurs à 2 cellules. Nous avons démontré qu’il s’agit d’un moyen efficace de produire des modèles animaux ciblés à frapper.

L’un des principaux avantages de l’utilisation de l’AAV est qu’elle permet d’administrer des modèles de réparation de l’ADN plus grands dans les embryons sans avoir besoin de techniques de micro-injection. L’administration médiée par l’AAV permet également de contourner quelque peu les restrictions de taille de la matrice d’ADN de l’électroporation seule. Cependant, il y a quelques considérations importantes à prendre en compte lors de l’utilisation de l’AAV. La zone pellucide, la matrice glycoprotéique durcie qui entoure l’ovule fécondé, sert de barrière physique qui complique souvent l’administration d’acides nucléiques. L’amincissement de la zone pellucide est une technique courante qui est utilisée pour un meilleur accès à l’embryon. Cependant, certaines études ont rapporté que le développement de l’embryon est entravé par l’infection par des doses plus élevées (1 × 107 GC/μL à 1 × 109 GC/μL) AAV chez les embryons dans lesquels la zone pellucide a été amincie avant l’infection par AAV22. Il existe cependant certains sérotypes de VAA qui peuvent se diffuser dans la zone pellucide29. Notre protocole n’implique pas d’amincissement de la zone pellucide et utilise l’AAV avec les sérotypes 1 et 6 à une concentration de 3 × 107 GC/μl pour obtenir des taux de knock-in plus élevés que les rapports précédemment publiés. Nous n’avons pas noté de diminution du développement embryonnaire dans ces conditions.

L’efficacité élevée de l’électroporation des embryons à 2 cellules est très probablement due à l’extension de la phase G2 chez les embryons à ce stade de développement, ce qui en fait une étape de développement optimale pour effectuer l’électroporation. Cependant, une complication potentielle est la fusion cellulaire observée dans certains embryons à 2 cellules pendant le processus d’électroporation. Cette observation n’est pas surprenante étant donné que les procédures d’électrofusion sont couramment utilisées pour fusionner des cellules de mammifères et que la fusion peut potentiellement être évitée par un alignement prudent des axes horizontaux plutôt que verticaux entre les électrodes30,31. De plus, lorsque l’édition du génome se produit à un stade ultérieur du développement, comme à 2 cellules plutôt qu’à 1 cellule, il existe un plus grand potentiel d’augmentation du mosaïcisme. En utilisant notre approche d’électroporation à 2 cellules, nous avons observé une légère augmentation du mosaïcisme par rapport à l’injection pronucléaire (86% pour l’approche AAV et 67% pour l’approche PNI) au stade 1 cellule, mais nous avons tout de même pu obtenir une transmission germinale de l’allèle modifié chez tous les animaux fondateurs testés. Une autre préoccupation potentielle est la possibilité d’une intégration de concatémères en tandem de matrices d’ADN dérivées de l’AAV. Bien que nous n’ayons pas effectué de séquençage à lecture longue pour les modèles décrits dans ce protocole, nous avons confirmé l’intégration unique des modèles d’ADN pour tous les modèles en utilisant la variation du nombre de copies par PCR numérique par gouttelettes (ddPCR).

Enfin, bien que notre méthode ait impliqué l’administration par AAV de séquences d’ADN d’intérêt, il devrait être possible d’utiliser d’autres approches d’administration d’ADN à médiation virale et non virale en conjonction avec l’électroporation d’embryons pour manipuler génétiquement avec succès les embryons. En conclusion, la combinaison de l’administration d’ADN médiée par ssAAV et de l’électroporation des RNP CRISPR-Cas9 dans des embryons au stade de 2 cellules est une méthode efficace et facilement adaptable pour générer efficacement des modèles de rats knock-in.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Nolan Davis pour son aide dans la vidéographie et le montage vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leads with alligator clips for electrodes NepaGene C117
Mineral oil MilliporeSigma M5310
NepaGene21 Super Electroporator  NepaGene NEPA21
Platinum plate electrodes on slide glass NepaGene CUY501P1-1.5
PURedit Cas9 Protein MilliporeSigma PECAS9
sgRNA (chemically-modified) Synthego N/A
ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template Vectorbuilder N/A

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Ce mois-ci dans JoVE Numéro 205 Virus adéno-associé (AAV) édition du génome CRISPR-Cas électroporation embryons à 2 cellules knock-in modèle animal de rat
Édition du génome CRISPR-Cas9 d’embryons de rats à l’aide d’un virus adéno-associé (AAV) et d’une électroporation d’embryons à 2 cellules
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J. Davis, D., McNew, J. F., Walls,… More

J. Davis, D., McNew, J. F., Walls, J. N., Bethune, C. E., Oswalt, P. S., Bryda, E. C. CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus (AAV) and 2-Cell Embryo Electroporation. J. Vis. Exp. (205), e66069, doi:10.3791/66069 (2024).

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