Summary
Este protocolo apresenta uma abordagem otimizada para a produção de modelos de ratos geneticamente modificados. O vírus adenoassociado (AAV) é usado para entregar um modelo de reparo de DNA, e a eletroporação é usada para entregar reagentes CRISPR-Cas9 para completar o processo de edição do genoma em embrião de 2 células.
Abstract
A tecnologia de edição do genoma é amplamente utilizada para produzir animais geneticamente modificados, incluindo ratos. A injeção citoplasmática ou pronuclear de moldes de reparo de DNA e reagentes CRISPR-Cas é o método de liberação mais comum em embriões. No entanto, esse tipo de micromanipulação requer acesso a equipamentos especializados, é trabalhoso e requer um certo nível de habilidade técnica. Além disso, as técnicas de microinjeção frequentemente resultam em menor sobrevivência do embrião devido ao estresse mecânico sobre o embrião. Neste protocolo, desenvolvemos um método otimizado para entregar grandes modelos de reparo de DNA para trabalhar em conjunto com a edição do genoma CRISPR-Cas9 sem a necessidade de microinjeção. Este protocolo combina a entrega de DNA mediada por AAV de modelos de doadores de DNA de fita simples juntamente com a entrega de ribonucleoproteína CRISPR-Cas9 (RNP) por eletroporação para modificar embriões de 2 células. Usando esta nova estratégia, produzimos com sucesso modelos de ratos knock-in direcionados carregando a inserção de sequências de DNA de 1,2 a 3,0 kb de tamanho com eficiências entre 42% e 90%.
Introduction
O desenvolvimento de ferramentas de edição do genoma baseadas em CRISPR acelerou nossa capacidade de gerar eficientemente novos e mais sofisticados modelos de ratos geneticamente modificados. O RNA guia-único, juntamente com a nuclease Cas9, é combinado para formar complexos de ribonucleoproteína (RNP) que têm como alvo sequências de DNA de interesse dentro do genoma e resultam em quebras de DNA de fita dupla. Como os mecanismos de reparo do DNA celular são propensos a erros, inserções e deleções (INDELs) são introduzidas durante o processo de reparo que podem interromper a função de um gene alvo. Quando há co-entrega de uma sequência de DNA projetada desejada (modelo de reparo) juntamente com reagentes de edição do genoma, a inserção do molde de reparo na região que contém a quebra de DNA de fita dupla ocorre por meio de um processo chamado reparo dirigido por homologia (HDR). Esta é uma estratégia eficaz para gerar modelos animais com inserções/substituições de DNA direcionadas (knock-ins). Uma limitação é que as sequências knock-in são frequentemente grandes em tamanho, o que demonstrou reduzir a eficiência da edição gênica, tornando a geração do modelo desejado mais difícil1. Estratégias para aumentar a eficiência do knock-in incluíram a linearização de modelos de reparo de DNA de fita dupla (dsDNA) e DNA de fita simples (ssDNA) e modificação química de modelos de reparo de DNA 2,3,4. Além disso, a microinjeção pronuclear juntamente com compostos estimuladores de HDR, a aplicação de pulsos elétricos em conjunto com a microinjeção e a microinjeção cronometrada em embriões de 2 células têm sido tentadas 5,6,7. Apesar do sucesso de algumas dessas abordagens, a incorporação de sequências de DNA maiores que 1,0 kb permanece tecnicamente desafiadora.
A eletroporação, que é um método comum para introduzir reagentes em linhagens celulares cultivadas, oferece uma alternativa à microinjeção para a entrega de componentes CRISPR-Cas9 em embriões. A eletroporação embrionária, demonstrada pela primeira vez em embriões de ratos8, tem sido utilizada com sucesso como método de liberação em camundongos 9,10,11,12,13, suínos 14,15 e outros organismos animaismodelo 16,17,18 . Os embriões, suspensos no meio contendo reagentes CRISPR-Cas9, são colocados em uma cubeta ou em uma lâmina de vidro entre dois eletrodos e submetidos a pulsos diretos de correntes elétricas. Isso cria aberturas transitórias na zona pelúcida e na membrana plasmática do embrião através das quais os componentes CRISPR-Cas9 entram nos embriões. Normalmente, pulsos elétricos de "poring" de nível médio são usados para criar as aberturas temporárias seguidas por "pulsos de transferência" elétricos de nível inferior que facilitam o movimento dos componentes de edição do genoma carregados negativamente. A eletroporação embrionária é eficiente, tem alto rendimento e é fácil de executar. No entanto, embora a eletroporação embrionária tenha se mostrado altamente bem-sucedida para a introdução de pequenos (<200 pb) modelos de reparo de ssDNA, há poucos relatos de eletroporação bem-sucedida de modelos de reparo maiores (>1,0 kb)13,19. Essa restrição de tamanho representa uma grande limitação da eletroporação embrionária por gerar modelos animais knock-in que requerem grandes inserções.
No contexto da terapia gênica, os vírus adenoassociados (AAVs) têm sido usados há muito tempo como veículos para liberar material genético devido à sua eficiente infectividade in vivo de células em divisão e não em divisão, ausência de patogenicidade e rara integração genômica20,21. Recentemente, mais estudos combinaram AAVs com a tecnologia CRISPR-Cas9 para introduzir modelos de reparo de DNA e reagentes CRISPR 22,23,24. Essa abordagem permite a entrega de modelos maiores de reparo de DNA sem a necessidade de técnicas de microinjeção.
A via HDR é mais ativa nas fases S tardia e G2 do ciclocelular25,26. Em estudos realizados in vitro, aumentos significativos na eficiência de knock-in foram alcançados pela entrega de RNPs CRISPR-Cas9 e modelos de reparo de DNA em células sincronizadas com G2 ou pela restrição da presença da proteína Cas9 às fases S e G2 tardias usando uma proteína de fusão Cas9-Geminin2. Além disso, há um grande evento de ativação do genoma zigótico (ZGA) que ocorre durante a fase G2 estendida do embrião em estágio de 2 células, e isso está associado a um estado de cromatina aberta. Especula-se que isso proporcione aos RNPs CRISPR-Cas9 e modelos de reparo maior acessibilidade ao DNA genômico.
Nosso objetivo foi desenvolver todas essas observações, combinando a abordagem AAV com eletroporação embrionária para introduzir RNPs CRISPR-Cas9 no estágio de 2 células do desenvolvimento embrionário. Essa estratégia aproveita a maior capacidade de entrega do molde de reparo de DNA do AAV, a facilidade técnica de eletroporação e o ponto de tempo de 2 células mais ideal para acessibilidade genômica durante o desenvolvimento do embrião para criar um método eficiente para engenharia genética direcionada de inserções de DNA. Como destacado neste protocolo, nosso método otimizado permite a produção de modelos de ratos knock-in direcionados carregando inserções de sequências de DNA de 1,2 a 3,0 kb de tamanho sem a necessidade de técnicas de microinjeção.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Missouri (protocolo ACUC #25580) e foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas no Guia para o Uso e Cuidado de Animais de Laboratório.
1. Entrega do modelo de reparo de DNA mediado por AAV
- Projete a construção de DNA para conter a sequência de knock-in desejada entre dois braços de homologia. Os comprimentos típicos dos braços de homologia são de 300-500 pb de comprimento. Certifique-se de que todo o molde de reparo de DNA (braços de homologia + sequência de knock-in desejada) seja flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) por clonagem em um backbone plasmidial apropriado e empacotamento em ssAAV1 ou ssAAV6 recombinantes (sorotipos 1 ou 6).
NOTA: Se a sequência alvo do sgRNA estiver presente no modelo de reparo de DNA, é importante projetar mutações silenciosas para interromper essa sequência, impedindo assim a edição mediada por CRISPR-Cas9 do alelo corretamente visado.
CUIDADO: Os vetores virais AAV recombinantes não são integradores e classificados como BSL-1. Técnicas assépticas padrão são usadas para pipetar e manipular embriões que foram expostos a vírus. - Adicionar ssAAV1 ou ssAAV6 projetados (embalados com molde de reparo de DNA) a 30 μL de meio KSOM-R27,28 para uma concentração final de 3 × 107 cópias do genoma (GC)/μL sob óleo mineral em placa de Petri de 35 mm.
- Coloque zigotos com pró-núcleos visíveis no meio KSOM-R contendo ssAAV projetado.
NOTA: Usando este protocolo, não há necessidade de afinar a zona pelúcida, pois os sorotipos 1 e 6 do AAV são capazes de passar prontamente para a entrega eficiente do molde de reparo de DNA. - Incubar a 37 °C com 5% de CO2 e humidade máxima durante 18-20 h para permitir uma transdução viral suficiente.
2. Preparação da eletroporação
- No dia seguinte, fazer uma mistura de eletroporação contendo 100 ng/μL de sgRNA e 100 ng/μL de proteína Cas9 diluída em meio Opti-MEM em um tubo estéril livre de RNase. Misture delicadamente.
- Incubar à temperatura ambiente por 10 min para permitir a formação da RNP.
- Durante o tempo de incubação, ligue o eletroporator e conecte os cabos a um eletrodo deslizante de vidro com folga de 1,5 mm.
- Defina os parâmetros de eletroporação conforme descrito na Tabela 1.
3. Eletroporação embrionária de 2 células
- Pipetar suavemente 5 μL da mistura de eletroporação CRISPR entre os dois eletrodos na lâmina de vidro, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução.
- Remova o embrião em estágio de 2 células da solução de AAV. Alinhe embriões em estágio de 2 células na mistura sem permitir que eles toquem nas laterais dos eletrodos. Isso é feito para evitar a lise.
- Pressione o botão Ohm para medir a impedância. Verifique se a impedância está entre 0,100 e 0,300 kΩ. O volume da reação irá alterar a impedância (adicionar volume para diminuir a impedância e subtrair volume para aumentar a impedância).
- Pressione Iniciar. O processo leva alguns segundos para ser concluído.
- Remover os embriões imediatamente após a eletroporação e lavar 3 vezes em gotas frescas de 30 μL do meio KSOM-R.
- Colocar os embriões novamente em estufa a 37 °C com 5% de CO2 e umidade máxima para cultivo in vitro em gotas de 500 μL do meio KSOM-R sob óleo mineral. Alternativamente, transfira cirurgicamente embriões para uma rata pseudogestante pós-coito (dpc) de 1,5 dia para produzir descendentes vivos.
Figura 1: Esquema da entrega de DNA mediada por AAV e pipeline de eletroporação embrionária de 2 células para edição do genoma CRISPR-Cas9. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
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Representative Results
Seguindo o protocolo, há uma entrega efetiva mediada por AAV do molde de reparo de DNA, permitindo HDR altamente eficiente após embriões de 2 células serem eletroporados com RNPs CRISPR-Cas9. Como mostrado no vídeo, um processo de eletroporação bem-sucedido resulta na formação de bolhas em cada eletrodo (Figura 2C) e a impedância permanece dentro da faixa de 0,100 e 0,300 kΩ. Após a eletroporação, não é incomum que os embriões inchem preenchendo o espaço perivitelino dentro da zona pelúcida (Figura 3). Esse inchaço deve diminuir após algumas horas em cultura. Também não é incomum observar uma pequena porcentagem (até 20%) de eventos de fusão celular após eletroporação de embriões de 2 células (Figura 3). A fusão celular pode ser potencialmente evitada pelo alinhamento cuidadoso do eixo horizontal em vez do alinhamento vertical do eixo entre os eletrodos (Figura 2B). No entanto, normalmente apenas descartamos quaisquer embriões fundidos após o processo de eletroporação.
Nossa entrega de DNA mediada por AAV com a técnica de eletroporação CRISPR-Cas9 RNP de embrião de 2 células provou ser altamente eficaz para gerar modelos de ratos knock-in com inserções direcionadas. Testando nosso método em embriões de ratos e rastreando blastocistos cultivados para uma inserção de um íntron artificial curto projetado contendo sítios loxP, observamos que mais de 60% dos blastocistos continham o alelo knock-in corretamente direcionado com base na análise de Next Generation Sequence (NGS) (Figura 4). Além disso, testando nosso método para produzir ratos vivos knock-in, projetamos um projeto para projetar uma sequência codificadora de recombinase Cre direcionada para o local de início ATG do gene Drd2 do rato. O molde de doador de DNA embalado com AAV consistiu de sequências ITR necessárias para o empacotamento de AAV, um braço de homologia de 5' (422pb de comprimento), uma sequência Cre-pA (1.339pb de comprimento) e um braço de homologia de 3' (477bp de comprimento) (Figura 5A). Dos 11 filhotes nascidos, 10 foram positivos pela análise de PCR para a sequência Cre-pA corretamente inserida no sítio de início da ATG do rato Drd2 (Figura 5B-D). A inserção do alvo foi posteriormente confirmada por análise de sequência de DNA. Como um resumo de 7 projetos diferentes, alcançamos uma taxa média de sucesso de 76% em animais fundadores, conforme determinado pela análise de PCR através de junções de braço de homologia e verificação de sequência de DNA (Tabela 2).
| Tensão [V] | Comprimento de Pulso [mseg] | Intervalo de Pulso [mseg] | # de Pulsos | Taxa de decaimento [%] | Polaridade | |
| Poring Pulse | 40 | 3.5 | 50 | 4 | 10 | + |
| Pulso de Transferência | 5 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
Tabela 1: Parâmetros de eletroporação. Certifique-se de que o limite de corrente esteja LIGADO durante a eletroporação.
Figura 2: Processo de eletroporação embrionária de 2 células. (A) Eletrodo de lâmina de vidro. (B) Embriões suspensos em reagentes de edição do genoma CRISPR-Cas9 e carregados no eletrodo de lâmina de vidro antes da eletroporação. (C) Formação de bolhas de ar em cada eletrodo durante a eletroporação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Aspecto do embrião após eletroporação. A fusão celular é observada em até 20% dos embriões de 2 células após a eletroporação. As células embrionárias também podem inchar dentro da zona pelúcida preenchendo o espaço perivitelino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Entrega de DNA mediada por AAV e eficiência da eletroporação embrionária de 2 células knock-in em cultura de blastocistos de ratos. Dados apresentados como porcentagem de blastocistos positivos para o alelo knock-in correto detectado por Next Generation Sequencing (NGS). N=28 blastocistos (grupo controle somente cultura), N=37 blastocistos (grupo controle somente eletroporação (EP)) e N=35 blastocistos (grupo AAV+EP). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Criação de um modelo de rato knock-in Drd2-Cre. (A) Direcionamento do gene Drd2 do rato. O complexo da RNP foi projetado para atingir o Exon 2, que contém o site de início da região codificadora. O molde do doador AAV continha sequências virais de repetição terminal invertida (ITR), braços de homologia dos genes Drd2 5' e 3' (HA) e o gene Cre com uma sequência poliA. A integração bem-sucedida do modelo de doador bate no gene Cre 3' para o local de início dentro do Exon 2. Isso coloca o gene Cre sob controle do promotor Drd2 e, ao mesmo tempo, nocauteia o gene Drd2. A localização dos primers de PCR utilizados para a confirmação do sucesso do knock-in é indicada por setas roxas. (B) Análise por PCR de animais potencialmente editados no genoma (Lanes B10-C8) com primers abrangendo o braço de homologia de 5'. Faixa C9: tipo selvagem (controle negativo); Faixa C10: sem gabarito (controle negativo). O tamanho esperado do amplicon para animais knock-in positivos é de 601pb. (C) Análise por PCR de animais potencialmente editados no genoma (Lanes D8-E6) com primers abrangendo o braço de homologia 3'. Faixa E7: tipo selvagem; Faixa E8: sem controle de modelo. O tamanho esperado do amplicon para animais knock-in positivos é de 676bp. (D) Detecção do gene Cre. O tamanho esperado do amplicon é de 381bp. Lanes C7-D5: potenciais fundadores; Faixa D6: tipo selvagem; Faixa D7: sem controle de modelo. As reações de PCR foram analisadas por eletroforese capilar com marcadores de alinhamento 15pb-3kb (indicados em verde). O marcador de tamanho QX DNA é mostrado à esquerda de cada imagem com o tamanho do pico correspondente ao tamanho do amplicon da PCR em pares de bases (pb). Esta figura é modificada com permissão da referência24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Descrição do projeto | Prole positiva para knock-in (%) |
| Oprm1-P2A-Flp (inserção de 1,7 kb) | 5/5 (100%) |
| Drd2-Cre (inserção de 1,3 kb) | 10/11 (91%) |
| Triml2-P2A-Cre (inserção de 1,3 kb) | 9/16 (56%) |
| Cxcl15-iCre (inserção de 1,3 kb) | 6/6 (100%) |
| Opn4-P2A-Cre (inserção de 1,2 kb) | 6/8 (75%) |
| Vipr1-FLEX-EGFP (inserção de 1,4 kb) | 5/12 (42%) |
| Rosa26-FLEX-MTS-KillerRed (inserção de 3,1 kb) | 5/7 (71%) |
Tabela 2: Taxas de sucesso do modelo knock-in
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Discussion
O sistema de edição do genoma CRISPR-Cas revolucionou o campo da engenharia genética ao permitir a produção eficiente de modificações genéticas simples e complexas e personalizadas em uma variedade de espécies animais. Refinamentos frequentes e melhorias nas técnicas associadas à edição do genoma aumentam sua versatilidade. Aqui descrevemos uma nova abordagem usando a entrega de DNA mediada por ssAAV juntamente com a eletroporação embrionária de 2 células de reagentes CRISPR-Cas9 em embriões de roedores de 2 células. Demonstrámos que esta é uma forma eficaz de produzir modelos animais de knock-in direcionados.
Uma grande vantagem do uso do AAV é que ele permite a entrega de modelos maiores de reparo de DNA em embriões sem a necessidade de técnicas de microinjeção. A entrega mediada por AAV também ajuda a contornar um pouco as restrições de tamanho do molde de DNA da eletroporação sozinha. No entanto, existem algumas considerações importantes ao usar AAV. A zona pelúcida, a matriz glicoproteica endurecida ao redor do óvulo fertilizado, serve como uma barreira física que muitas vezes complica a entrega de ácidos nucleicos. O afinamento da zona pelúcida é uma técnica comum que é usada para melhor acesso ao embrião. Entretanto, alguns estudos relatam que o desenvolvimento embrionário é prejudicado pela infecção com doses maiores (1 × 107 GC/μL a 1 ×10 9 GC/μL) de AAV em embriões nos quais a zona pelúcida foi afinada antes da infecção pelo AAV22. Existem, entretanto, alguns sorotipos de AAV que podem se difundir pela zona pelúcida29. Nosso protocolo não envolve afinamento da zona pelúcida e utiliza AAV com os sorotipos 1 e 6 na concentração de 3 × 107 GC/μl para atingir taxas de knock-in superiores às relatadas anteriormente. Não observamos diminuição do desenvolvimento embrionário nessas condições.
A alta eficiência de knock-in alcançada pela eletroporação de embriões de 2 células é provavelmente devido à fase G2 estendida em embriões nesta fase de desenvolvimento, tornando esta uma fase de desenvolvimento ideal para realizar a eletroporação. No entanto, uma complicação potencial é a fusão celular observada em alguns embriões de 2 células durante o processo de eletroporação. Essa observação não é surpreendente, uma vez que os procedimentos de eletrofusão são comumente usados para fundir células de mamíferos e a fusão pode ser potencialmente evitada pelo cuidadoso alinhamento horizontal ao invés do eixo vertical entre os eletrodos30,31. Além disso, quando a edição do genoma ocorre em um estágio posterior do desenvolvimento, como 2 células em vez de 1 célula, há maior potencial para aumento do mosaicismo. Usando nossa abordagem de eletroporação de 2 células, observamos um ligeiro aumento no mosaicismo em comparação com a injeção pronuclear (86% para a abordagem AAV e 67% para a abordagem PNI) em um estágio de 1 célula, mas ainda assim fomos capazes de alcançar a transmissão germinativa do alelo modificado em todos os animais fundadores testados. Outra preocupação potencial é a possibilidade de integração de concatenômeros em tandem de modelos de DNA derivados de AAV. Embora não tenhamos realizado sequenciamento de leitura longa para os modelos descritos neste protocolo, confirmamos a integração única dos modelos de DNA para todos os modelos usando variação no número de cópias por PCR digital em gota (ddPCR).
Finalmente, enquanto nosso método envolveu a entrega de sequências de DNA de interesse por AAV, deve ser possível usar outras abordagens de entrega de DNA mediadas por vírus e não virais em conjunto com a eletroporação embrionária para manipular geneticamente embriões com sucesso. Em conclusão, a combinação da entrega de DNA mediada por ssAAV e eletroporação de RNPs CRISPR-Cas9 em embriões em estágio de 2 células é um método eficiente e facilmente adaptável para a geração eficiente de modelos de rato.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Nolan Davis pela assistência com videografia e edição de vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
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