Summary
Este protocolo presenta un enfoque optimizado para la producción de modelos de ratas modificadas genéticamente. El virus adenoasociado (AAV) se utiliza para administrar una plantilla de reparación de ADN, y la electroporación se utiliza para administrar reactivos CRISPR-Cas9 para completar el proceso de edición del genoma en un embrión de 2 células.
Abstract
La tecnología de edición genómica se utiliza ampliamente para producir animales modificados genéticamente, incluidas las ratas. La inyección citoplasmática o pronuclear de plantillas de reparación de ADN y reactivos CRISPR-Cas es el método de administración más común en embriones. Sin embargo, este tipo de micromanipulación requiere el acceso a equipos especializados, es laboriosa y requiere un cierto nivel de habilidad técnica. Además, las técnicas de microinyección a menudo dan como resultado una menor supervivencia embrionaria debido al estrés mecánico en el embrión. En este protocolo, desarrollamos un método optimizado para entregar grandes plantillas de reparación de ADN para que funcionen junto con la edición del genoma CRISPR-Cas9 sin necesidad de microinyección. Este protocolo combina la entrega de ADN mediada por AAV de plantillas de donantes de ADN monocatenario junto con la administración de ribonucleoproteína CRISPR-Cas9 (RNP) por electroporación para modificar embriones de 2 células. Utilizando esta novedosa estrategia, hemos producido con éxito modelos de ratas knock-in dirigidas que llevan la inserción de secuencias de ADN de 1,2 a 3,0 kb de tamaño con eficiencias entre el 42% y el 90%.
Introduction
El desarrollo de herramientas de edición genómica basadas en CRISPR ha acelerado nuestra capacidad para generar de manera eficiente modelos de ratas modificados genéticamente nuevos y más sofisticados. El ARN de guía única, junto con la nucleasa Cas9, se combina para formar complejos de ribonucleoproteína (RNP) que se dirigen a secuencias de ADN de interés dentro del genoma y dan lugar a roturas de ADN bicatenario. Debido a que los mecanismos de reparación del ADN celular son propensos a errores, se introducen inserciones y deleciones (INDEL) durante el proceso de reparación que pueden interrumpir la función de un gen diana. Cuando hay una entrega conjunta de una secuencia de ADN modificada deseada (plantilla de reparación) junto con reactivos de edición del genoma, la inserción de la plantilla de reparación en la región que contiene la rotura del ADN bicatenario se produce a través de un proceso llamado reparación dirigida por homología (HDR). Se trata de una estrategia eficaz para generar modelos animales con inserciones/sustituciones de ADN dirigidas (knock-ins). Una limitación es que las secuencias knock-in suelen ser de gran tamaño, lo que se ha demostrado que reduce la eficiencia de la edición de genes, lo que dificulta la generación del modelo deseado1. Las estrategias para aumentar la eficiencia de los knock-in han incluido la linealización de las plantillas de reparación de ADN bicatenario (dsDNA) y ADN monocatenario (ssDNA) y la modificación química de las plantillas de reparación del ADN 2,3,4. Además, se ha intentado la microinyección pronuclear junto con compuestos estimulantes HDR, la aplicación de pulsos eléctricos junto con la microinyección y la microinyección programada en embriones de 2 células 5,6,7. A pesar del éxito de algunos de estos enfoques, la incorporación de secuencias de ADN de más de 1,0 kb sigue siendo un reto técnico.
La electroporación, que es un método común para introducir reactivos en líneas celulares cultivadas, ofrece una alternativa a la microinyección para administrar componentes CRISPR-Cas9 en embriones. La electroporación embrionaria, demostrada por primera vez en embriones de rata8, se ha utilizado desde entonces con éxito como método de administración en ratones 9,10,11,12,13, cerdos14,15 y otros organismos modelo animal 16,17,18. Los embriones, suspendidos en el medio que contiene los reactivos CRISPR-Cas9, se colocan en una cubeta o en un portaobjetos de vidrio entre dos electrodos y se someten a pulsos directos de corrientes eléctricas. Esto crea aberturas transitorias en la zona pelúcida y en la membrana plasmática embrionaria a través de las cuales los componentes CRISPR-Cas9 entran en los embriones. Por lo general, se utilizan pulsos eléctricos de "poro" de nivel medio para crear las aberturas temporales seguidas de "pulsos de transferencia" eléctricos de nivel inferior que facilitan el movimiento de los componentes de edición del genoma cargados negativamente. La electroporación embrionaria es eficiente, tiene un alto rendimiento y es fácil de realizar. Sin embargo, mientras que la electroporación embrionaria ha demostrado ser muy exitosa para la introducción de plantillas de reparación de ADNs pequeñas (<200 pb), hay pocos informes de electroporación exitosa de plantillas de reparación más grandes (>1,0 kb)13,19. Esta restricción de tamaño representa una limitación importante de la electroporación embrionaria para generar modelos animales knock-in que requieren grandes inserciones.
En el contexto de la terapia génica, los virus adenoasociados (AAV) se han utilizado durante mucho tiempo como vehículos para entregar material genético debido a su eficiente infectividad in vivo de células en división y no división, falta de patogenicidad y rara integración genómica20,21. Recientemente, más estudios han combinado los AAV con la tecnología CRISPR-Cas9 para introducir plantillas de reparación de ADN y reactivos CRISPR 22,23,24. Este enfoque permite la entrega de plantillas de reparación de ADN más grandes sin necesidad de técnicas de microinyección.
La vía HDR es más activa en las fases tardías S y G2 del ciclo celular25,26. En estudios realizados in vitro, se lograron aumentos significativos en la eficiencia de knock-in mediante la administración de RNP CRISPR-Cas9 y plantillas de reparación de ADN en células sincronizadas con G2 o mediante la restricción de la presencia de la proteína Cas9 a las fases S y G2 tardías utilizando una proteína de fusión Cas9-Geminina2. Además, hay un evento importante de activación del genoma cigótico (ZGA) que ocurre durante la fase G2 extendida del embrión en etapa de 2 células, y esto se asocia con un estado de cromatina abierta. Se especula que esto proporciona a los RNPs CRISPR-Cas9 y a las plantillas de reparación una mayor accesibilidad al ADN genómico.
Nuestro objetivo era basarnos en todas estas observaciones, combinando el enfoque AAV con la electroporación embrionaria para introducir RNPs CRISPR-Cas9 en la etapa de 2 células del desarrollo embrionario. Esta estrategia aprovecha la mayor capacidad de entrega de plantillas de reparación de ADN de AAV, la facilidad técnica de la electroporación y el punto de tiempo más óptimo de 2 células para la accesibilidad genómica durante el desarrollo embrionario para crear un método eficiente para la ingeniería genética dirigida de las inserciones de ADN. Como se destaca en este protocolo, nuestro método optimizado permite la producción de modelos de ratas knock-in dirigidas que llevan inserciones de secuencias de ADN de 1,2 a 3,0 kb de tamaño sin necesidad de técnicas de microinyección.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Missouri (protocolo ACUC #25580) y se realizaron de acuerdo con las pautas establecidas en la Guía para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio.
1. Entrega de plantillas de reparación de ADN mediada por AAV
- Diseñe la construcción de ADN para que contenga la secuencia de knock-in deseada entre dos brazos de homología. Las longitudes típicas de los brazos de homología son de 300-500 pb de longitud. Asegúrese de que toda la plantilla de reparación del ADN (brazos de homología + secuencia de knock-in deseada) esté flanqueada por repeticiones terminales invertidas (ITR) mediante la clonación en una columna vertebral de plásmido adecuada y el empaquetado en ssAAV1 o ssAAV6 recombinantes (serotipos 1 o 6).
NOTA: Si la secuencia diana del sgRNA está presente en la plantilla de reparación del ADN, es importante diseñar mutaciones silenciosas para interrumpir esta secuencia, evitando así la edición mediada por CRISPR-Cas9 del alelo al que se dirige correctamente.
PRECAUCIÓN: Los vectores virales AAV recombinantes no se integran y se clasifican como BSL-1. Las técnicas asépticas estándar se utilizan para pipetear y manipular embriones que han estado expuestos al virus. - Añadir ssAAV1 o ssAAV6 (envasado con plantilla de reparación de ADN) a 30 μL de KSOM-Rmedio 27,28 a una concentración final de 3 × 107 copias del genoma (GC)/μL bajo aceite mineral en una placa de Petri de 35 mm.
- Coloque cigotos con pronúcleos visibles en el medio KSOM-R que contiene ssAAV diseñado.
NOTA: Con este protocolo no es necesario adelgazar la zona pelúcida, ya que los serotipos 1 y 6 de AAV pueden pasar fácilmente para una entrega eficiente de la plantilla de reparación del ADN. - Incubar a 37 °C con 5% de CO2 y humedad máxima durante 18-20 h para permitir una transducción viral suficiente.
2. Preparación de la electroporación
- Al día siguiente, prepare una mezcla de electroporación que contenga 100 ng/μL de sgRNA y 100 ng/μL de proteína Cas9 diluida en medios Opti-MEM en un tubo estéril libre de RNasa. Mezcle suavemente.
- Incubar a temperatura ambiente durante 10 min para permitir la formación de RNP.
- Durante el tiempo de incubación, encienda el electroporador y conecte los cables a un electrodo deslizante de vidrio con un espacio de 1,5 mm.
- Establezca los parámetros de electroporación como se describe en la Tabla 1.
3. Electroporación de embriones de 2 células
- Pipetear suavemente 5 μL de la mezcla de electroporación CRISPR entre los dos electrodos en el portaobjetos de vidrio, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la solución.
- Retire el embrión en estadio de 2 células de la solución de AAV. Alinee los embriones en etapa de 2 células en la mezcla sin permitir que toquen los lados de los electrodos. Esto se hace para evitar la lisis.
- Presione el botón Ohm para medir la impedancia. Verifique que la impedancia esté entre 0.100 y 0.300 kΩ. El volumen de reacción alterará la impedancia (agregue volumen para disminuir la impedancia y reste volumen para aumentar la impedancia).
- Presione Inicio. El proceso tarda unos segundos en completarse.
- Extraer los embriones inmediatamente después de la electroporación y lavar 3 veces en gotas frescas de 30 μL de medio KSOM-R.
- Vuelva a colocar los embriones en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 y humedad máxima para el cultivo in vitro en gotas de 500 μL de medio KSOM-R bajo aceite mineral. Alternativamente, transfiere quirúrgicamente los embriones a una rata hembra pseudopreñada post-coito (dpc) de 1,5 días para producir descendencia viva.
Figura 1: Esquema de la entrega de ADN mediada por AAV y la tubería de electroporación de embriones de 2 células para la edición del genoma CRISPR-Cas9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
Siguiendo el protocolo, existe una administración efectiva mediada por AAV de la plantilla de reparación del ADN que permite un HDR altamente eficiente después de que los embriones de 2 células se electroporan con CRISPR-Cas9 RNP. Como se muestra en el video, un proceso de electroporación exitoso da como resultado la formación de burbujas en cada electrodo (Figura 2C) y la impedancia permanece dentro del rango de 0.100 y 0.300 kΩ. Después de la electroporación, no es raro que los embriones se hinchen, llenando el espacio perivitelino dentro de la zona pelúcida (Figura 3). Esta hinchazón debería desaparecer después de unas horas en cultivo. Tampoco es raro ver un pequeño porcentaje (hasta el 20%) de eventos de fusión celular después de electroporar embriones de 2 células (Figura 3). La fusión celular puede evitarse mediante una cuidadosa alineación del eje horizontal en lugar de una alineación del eje vertical entre los electrodos (Figura 2B). Sin embargo, normalmente descartamos los embriones fusionados después del proceso de electroporación.
Nuestra técnica de electroporación CRISPR-Cas9 RNP mediada por AAV con embriones de 2 células ha demostrado ser altamente efectiva para generar modelos de ratas knock-in con inserciones específicas. Al probar nuestro método en embriones de rata y seleccionar blastocistos cultivados para la inserción de un intrón artificial corto diseñado que contiene sitios loxP, observamos que más del 60% de los blastocistos contenían el alelo knock-in correctamente dirigido según el análisis de secuencia de próxima generación (NGS) (Figura 4). Además, probando nuestro método para producir ratas knock-in vivas, diseñamos un proyecto para diseñar una secuencia codificante de recombinasa Cre dirigida al sitio de inicio ATG del gen Drd2 de rata. La plantilla de donante de ADN empaquetado con AAV consistió en las secuencias de ITR necesarias para el empaquetamiento de AAV, un brazo de homología de 5' (422 pb de longitud), una secuencia de Cre-pA (1.339 pb de longitud) y un brazo de homología de 3' (477 pb de longitud) (Figura 5A). De las 11 crías nacidas, 10 fueron positivas mediante análisis de PCR para la secuencia Cre-pA correctamente insertada en el sitio de inicio de ATG de la rata Drd2 (Figura 5B-D). La inserción dirigida fue confirmada posteriormente por el análisis de la secuencia de ADN. Como resumen de 7 proyectos diferentes, hemos logrado una tasa media de éxito del 76% en animales fundadores, según lo determinado por el análisis de PCR en las uniones de los brazos de homología y la verificación de la secuencia de ADN (Tabla 2).
| Voltaje [V] | Longitud del pulso [mseg] | Intervalo de pulso [mseg] | # de Legumbres | Tasa de decaimiento [%] | Polaridad | |
| Pulso de poros | 40 | 3.5 | 50 | 4 | 10 | + |
| Pulso de transferencia | 5 | 50 | 50 | 5 | 40 | +/- |
Tabla 1: Parámetros de electroporación. Asegúrese de que el límite de corriente esté activado durante la electroporación.
Figura 2: Proceso de electroporación de embriones de 2 células. (A) Electrodo de portaobjetos de vidrio. (B) Embriones suspendidos en reactivos de edición genómica CRISPR-Cas9 y cargados en el electrodo de portaobjetos de vidrio antes de la electroporación. (C) Formación de burbujas de aire en cada electrodo durante la electroporación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Aspecto embrionario tras electroporación. La fusión celular se observa hasta en el 20% de los embriones de 2 células después de la electroporación. Las células embrionarias también pueden hincharse dentro de la zona pelúcida, llenando el espacio perivitelino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Entrega de ADN mediada por AAV y eficiencia de knock-in de electroporación de embriones de 2 células en blastocistos de rata en cultivo. Los datos se presentan como porcentaje de blastocistos positivos para la correcta detección de alelos knock-in mediante secuenciación de nueva generación (NGS). N = 28 blastocistos (grupo de control solo de cultivo), N = 37 blastocistos (grupo de control solo electroporación (EP)) y N = 35 blastocistos (grupo AAV + EP). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Creación de un modelo de rata knock-in Drd2-Cre. (A) Orientación del gen Drd2 de rata. El complejo RNP fue diseñado para apuntar al exón 2 que contiene el sitio de inicio de la región codificante. La plantilla de donante de AAV contenía secuencias de repetición terminal invertidas virales (ITR), brazos de homología del gen Drd2 (HA) 5' y 3' y el gen Cre con una secuencia poliA. La integración exitosa de la plantilla donante golpea el gen Cre 3' en el sitio de inicio dentro del exón 2. Esto pone el gen Cre bajo el control del promotor Drd2 y, al mismo tiempo, elimina el gen Drd2. La ubicación de los cebadores de PCR utilizados para la confirmación del knock-in exitoso se indica con flechas moradas. (B) Análisis de PCR de animales potencialmente editados con genoma (carriles B10-C8) con cebadores que abarcan todo el brazo de homología 5'. Carril C9: tipo salvaje (control negativo); Carril C10: sin plantilla (control negativo). El tamaño esperado del amplicón para los animales knock-in positivos es de 601 pb. (C) Análisis de PCR de animales potencialmente editados en el genoma (carriles D8-E6) con cebadores que abarcan todo el brazo de homología 3'. Carril E7: tipo salvaje; Carril E8: sin control de plantilla. El tamaño esperado del amplicón para los animales knock-in positivos es de 676 pb. (D) Detección del gen Cre. El tamaño esperado del amplicón es de 381 pb. Carriles C7-D5: potenciales fundadores; Carril D6: tipo salvaje; Carril D7: sin control de plantilla. Las reacciones de PCR se analizaron mediante electroforesis capilar con marcadores de alineación de 15pb-3kb (indicados en verde). El marcador de tamaño de ADN QX se muestra a la izquierda de cada imagen con un tamaño de pico correspondiente al tamaño del amplicón de PCR en pares de bases (pb). Esta figura está modificada con permiso de la referencia24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Descripción del proyecto | Descendencia positiva para knock-in (%) |
| Oprm1-P2A-Flp (inserción de 1,7 kb) | 5/5 (100%) |
| Drd2-Cre (inserción de 1.3 kb) | 10/11 (91%) |
| Triml2-P2A-Cre (inserción de 1,3 kb) | 9/16 (56%) |
| Cxcl15-iCre (inserción de 1.3 kb) | 6/6 (100%) |
| Opn4-P2A-Cre (inserción de 1,2 kb) | 6/8 (75%) |
| Vipr1-FLEX-EGFP (inserción de 1,4 kb) | 5/12 (42%) |
| Rosa26-FLEX-MTS-KillerRed (inserción de 3.1 kb) | 5/7 (71%) |
Tabla 2: Tasas de éxito del modelo knock-in
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Discussion
El sistema de edición genómica CRISPR-Cas ha revolucionado el campo de la ingeniería genética al permitir la producción eficiente de modificaciones genéticas personalizadas tanto sencillas como complejas en una variedad de especies animales. Los frecuentes refinamientos y mejoras en las técnicas asociadas con la edición del genoma aumentan su versatilidad. Aquí hemos descrito un nuevo enfoque que utiliza la entrega de ADN mediada por ssAAV junto con la electroporación embrionaria de 2 células de reactivos CRISPR-Cas9 en embriones de roedores de 2 células. Hemos demostrado que esta es una forma eficaz de producir modelos animales de knock-in dirigidos.
Una de las principales ventajas del uso de AAV es que permite la administración de plantillas de reparación de ADN más grandes en embriones sin necesidad de técnicas de microinyección. La administración mediada por AAV también ayuda a eludir de alguna manera las restricciones de tamaño de la plantilla de ADN de la electroporación sola. Sin embargo, hay algunas consideraciones importantes al usar AAV. La zona pelúcida, la matriz de glicoproteína endurecida que rodea al óvulo fertilizado, sirve como una barrera física que a menudo complica la administración de ácidos nucleicos. El adelgazamiento de la zona pelúcida es una técnica común que se utiliza para un mejor acceso al embrión. Sin embargo, algunos estudios han reportado que el desarrollo embrionario se ve obstaculizado por la infección con dosis más altas (1 × 107 GC/μL a 1 × 109 GC /μL) de AAV en embriones en los que la zona pelúcida estaba adelgazada antes de la infección por AAV22. Sin embargo, existen algunos serotipos de VAA que pueden difundirse a través de la zona pelúcida29. Nuestro protocolo no implica el adelgazamiento de la zona pelúcida y utiliza AAV con los serotipos 1 y 6 a una concentración de 3 × 107 GC/μl para lograr tasas de knock-in superiores a las publicadas anteriormente. No observamos disminución del desarrollo embrionario en estas condiciones.
La alta eficiencia de knock-in lograda por la electroporación de embriones de 2 células se debe probablemente a la fase G2 extendida en los embriones en esta etapa de desarrollo, lo que la convierte en una etapa de desarrollo óptima en la que realizar la electroporación. Sin embargo, una complicación potencial es la fusión celular observada en algunos embriones de 2 células durante el proceso de electroporación. Esta observación no es sorprendente dado que los procedimientos de electrofusión se utilizan comúnmente para fusionar células de mamíferos y la fusión puede evitarse mediante una cuidadosa alineación de los ejes horizontal en lugar de vertical entre los electrodos30,31. Además, cuando la edición del genoma se produce en una etapa posterior del desarrollo, como 2 células en lugar de 1 célula, existe un mayor potencial de aumento del mosaicismo. Utilizando nuestro enfoque de electroporación de 2 células, observamos un ligero aumento en el mosaicismo en comparación con la inyección pronuclear (86% para el enfoque AAV y 67% para el enfoque PNI) en una etapa de 1 célula, pero aún así pudimos lograr la transmisión de la línea germinal del alelo modificado en todos los animales fundadores probados. Otra preocupación potencial es la posibilidad de la integración de concatemeros en tándem de plantillas de ADN derivadas de AAV. Si bien no realizamos una secuenciación de lectura larga para los modelos descritos en este protocolo, sí confirmamos la integración única de las plantillas de ADN para todos los modelos utilizando la variación del número de copias de PCR digital en gotas (ddPCR).
Por último, si bien nuestro método implicaba la entrega de AAV de secuencias de ADN de interés, debería ser posible utilizar otros enfoques de administración de ADN mediados por virus y no virales junto con la electroporación embrionaria para manipular genéticamente embriones con éxito. En conclusión, la combinación de la entrega de ADN mediada por ssAAV y la electroporación de RNP CRISPR-Cas9 en embriones en etapa de 2 células es un método eficiente y fácilmente adaptable para generar modelos de ratas knock-in de manera eficiente.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Nolan Davis por su ayuda con la videografía y la edición de video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
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