न्युट्रोफिल अलगाव प्रोटोकॉल
Summary
Neutrophils सूजन प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साइट पर आने के लिए सबसे पहले कोशिकाओं के बीच हैं, और उनके कार्यों और तंत्र इन विट्रो में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है. हम एक मानक घनत्व ढाल जुदाई विधि पूरे रक्त का उपयोग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जुदाई मीडिया से मानव neutrophils अलग प्रदर्शित करता है.
Abstract
न्युट्रोफिल polymorphonuclear granulocytes (PMN) मनुष्यों में और सूजन प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साइट पर आने के लिए सबसे पहले कोशिकाओं के बीच सबसे प्रचुर मात्रा में leukocytes में हैं. सूजन में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, हरकत, cytokine उत्पादन, phagocytosis, और ट्यूमर कोशिका का मुकाबला जैसे न्युट्रोफिल कार्य बड़े पैमाने पर अध्ययन कर रहे हैं. Neutrophils के विशिष्ट कार्यों विशेषताएँ के लिए, उन्हें अन्य रक्त कोशिकाओं से अलग की एक साफ, तेज, और विश्वसनीय विधि के लिए इन विट्रो अध्ययन में वांछनीय है, खासकर के बाद से neutrophils अल्पकालिक हैं और संग्रह के 2-4 घंटे के भीतर प्रयोग किया जाना चाहिए. यहाँ, हम एक मानक घनत्व ढाल जुदाई विधि पूरे रक्त का उपयोग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जुदाई मीडिया है कि सोडियम metrizoate और Dextran 500 का एक मिश्रण है से मानव neutrophils अलग प्रदर्शित करता है. प्रक्रिया layering घनत्व ढाल मध्यम, centrifugation न्युट्रोफिल परत की जुदाई, और अवशिष्ट एरिथ्रोसाइट्स के lysis पर पूरे रक्त के होते हैं. कोशिकाओं तो धो रहे हैं, गिना, और इच्छित एकाग्रता के लिए बफर में resuspended. जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, इस विधि के लिए>> 95% व्यवहार्यता के साथ 95% neutrophils के नमूने उपज के लिए दिखाया गया है.
Protocol
Discussion
घनत्व ढाल जुदाई विधि सोडियम metrizoate और Dextran 500 का एक मिश्रण का उपयोग कर पूरे रक्त से मानव neutrophils अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस विधि mononuclear Boyum (1968) द्वारा ल्युकोसैट जुदाई तरीका है जो न्युट्रोफिल जुदाई के लिए Ferrante और पे?…
Acknowledgements
एनआईएच R01 HL56621 से अनुदान.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Lymphocyte Poly(R) | Reagent | Cedarlane Labs | PolymorphprepTM can be used as an alternative | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen Gibco | ||
| Human Serum Albumin | Reagent | ZLB Bioplasma | ||
| Red Cell Lysis Buffer | Reagent | Roche Diagnostics | ||
| Centrifuge | Tool | |||
| Vortexer | Tool | |||
| Pasteur Pipettes and bulb | Tool | |||
| PolymorphprepTM | Reagent | Axis-Shield PoC | Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R) | |
| Syringe Filter | Other | Millipore | SLGV033RS | Millex-GV, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable |
| Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen Gibco |
References
- Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, 77-83 (1968).
- England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
- Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
- Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
