Los neutrófilos se encuentran entre las primeras células en llegar al sitio de la respuesta inmune inflamatoria, y sus funciones y mecanismos han sido ampliamente estudiados in vitro. Se demuestra un gradiente de densidad estándar método de separación para aislar los neutrófilos humanos de sangre entera utilizando los medios disponibles en el mercado de separación.
Abstract
Granulocitos neutrófilos polimorfonucleares (PMN) son los leucocitos más abundantes en los seres humanos y entre las primeras células en llegar al sitio de la respuesta inmune inflamatoria. Debido a su papel clave en la inflamación, las funciones de los neutrófilos como la locomoción, la producción de citoquinas, fagocitosis, y combatir las células tumorales son ampliamente estudiados. Para la caracterización de las funciones específicas de los neutrófilos, un método limpio, rápido y confiable de que los separa de otras células sanguíneas es deseable que los estudios in vitro, sobre todo porque los neutrófilos son de corta duración y deben ser utilizados dentro de 2-4 horas de su recolección. Este sentido, demuestran un gradiente de densidad estándar método de separación para aislar los neutrófilos humanos de sangre entera utilizando los medios disponibles en el mercado de separación que es una mezcla de sodio y metrizoato Dextran 500. El procedimiento consiste en capas de sangre entera en el medio de gradiente de densidad, centrifugación, separación de la capa de neutrófilos, y la lisis de los eritrocitos residual. Las células se lavan, se cuentan y se resuspendieron en tampón de concentración que se desee. Cuando se realiza correctamente, este método ha demostrado que el rendimiento de las muestras de> 95% de neutrófilos con la viabilidad> 95%.
Protocol
Aislamiento de neutrófilos Protocolo Mantener los reactivos a temperatura ambiente. Recoger 5,0 ml de medios de aislamiento de los neutrófilos en tubo de centrífuga. Cuidadosamente la capa de 5,0 ml de sangre sobre los medios de separación. Realizar este paso, lenta y cuidadosamente, y con la punta de la pipeta cerca de la superficie de los medios de comunicación para evitar la mezcla de la sangre y los medios de comunicación. Centrifugar a 500 RCF durante 35 minutos a 20-25 ° C. La…
Discussion
El gradiente de densidad método de separación se utiliza para aislar los neutrófilos humanos de sangre total usando una mezcla de sodio y metrizoato Dextran 500. Este método se basa en el método de separación de leucocitos mononucleares por Boyum (1968), que fue modificada para la separación de los neutrófilos por Ferrante y Correa (1980).
Después de la recolección de un donante, la sangre entera pueden ser anticoagulados con EDTA, citrato o heparina. Ya que son de corta duración, los neutrófilos se debe utilizar dentro …
Acknowledgements
Financiación de los NIH R01 HL56621.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Lymphocyte Poly(R)
Reagent
Cedarlane Labs
PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride
Reagent
Invitrogen Gibco
Human Serum Albumin
Reagent
ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer
Reagent
Roche Diagnostics
Centrifuge
Tool
Vortexer
Tool
Pasteur Pipettes and bulb
Tool
PolymorphprepTM
Reagent
Axis-Shield PoC
Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter
Other
Millipore
SLGV033RS
Millex-GV, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride