Neutrophile Granulozyten gehören zu den ersten Zellen, die auf dem Gelände der entzündlichen Immunantwort kommen, und ihre Funktionen und Mechanismen wurden ausführlich in vitro untersucht. Wir zeigen eine Standard-Dichtegradienten Trennverfahren für die menschliche Neutrophile aus dem Vollblut unter Verwendung kommerziell erhältlicher Trennmedien isolieren.
Abstract
Neutrophile polymorphkernige Granulozyten (PMN) sind die häufigsten Leukozyten bei Menschen und unter den ersten Zellen, die auf dem Gelände der entzündlichen Immunantwort kommen. Aufgrund ihrer Schlüsselrolle bei Entzündungen sind neutrophile Funktionen wie Fortbewegung, die Produktion von Zytokinen, Phagozytose und Tumorzellen zu bekämpfen intensiv untersucht. Zur Charakterisierung der spezifischen Funktionen der neutrophilen Granulozyten, ist eine saubere, schnelle und zuverlässige Methode zur Trennung von anderen Blutzellen wünschenswert, in-vitro-Studien, zumal Neutrophilen kurzlebig sind und sollte innerhalb von 2-4 Stunden nach der Entnahme verwendet werden. Hier zeigen wir eine Standard-Dichtegradienten Trennverfahren für die menschliche Neutrophile aus dem Vollblut unter Verwendung kommerziell erhältlicher Trennung Medien, die eine Mischung aus Natrium-metrizoate und Dextran 500 ist zu isolieren. Das Verfahren besteht aus Schichten Vollblut über den Dichtegradienten-Medium, Zentrifugation, Trennung von neutrophilen Schicht und Lyse der restlichen Erythrozyten. Die Zellen werden dann gewaschen, gezählt und in Puffer resuspendiert, um gewünschte Konzentration. Wenn richtig ausgeführt, hat diese Methode wurde gezeigt, dass Proben von> 95% Neutrophile mit> 95% Lebensfähigkeit zu erhalten.
Protocol
Neutrophile Isolation Protocol Bringen Sie alle Reagenzien auf Raumtemperatur. Sammeln Sie 5,0 ml der neutrophilen Isolation Medien in Zentrifugenröhrchen. Sorgfältig Schicht 5,0 ml Blut über die Trennung Medien. Führen Sie diesen Schritt langsam und vorsichtig, und mit der Pipettenspitze dicht an der Oberfläche der Medien zur Vermeidung der Vermischung des Blutes und der Medien. Zentrifuge bei 500 RCF für 35 min bei 20-25 ° C. Das Blut sollte trennen in 6 verschiedenen Bands: Plasm…
Discussion
Der Dichtegradient Trennverfahren wird verwendet, um menschliche Neutrophile aus Vollblut mit einer Mischung aus Natrium-metrizoate und Dextran 500 zu isolieren. Diese Methode basiert auf den mononukleären Leukozyten Trennverfahren durch Boyum (1968), die für die Neutrophilen Trennung von Ferrante und Thong (1980) wurde modifiziert, basiert.
Nach der Entnahme aus einem Spender, kann Vollblut mit EDTA, Citrat oder Heparin antikoaguliert werden. Da sie kurzlebig sind, sollten Neutrophilen innerhalb von 2-4 Stunden nach der Entnahme …
Acknowledgements
Die Finanzierung von NIH R01 HL56621.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Lymphocyte Poly(R)
Reagent
Cedarlane Labs
PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride
Reagent
Invitrogen Gibco
Human Serum Albumin
Reagent
ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer
Reagent
Roche Diagnostics
Centrifuge
Tool
Vortexer
Tool
Pasteur Pipettes and bulb
Tool
PolymorphprepTM
Reagent
Axis-Shield PoC
Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter
Other
Millipore
SLGV033RS
Millex-GV, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride