Neutrófilos estão entre as primeiras células a chegar ao local da resposta imune inflamatória, e suas funções e mecanismos têm sido estudadas extensivamente in vitro. Demonstramos um nível de densidade gradiente método de separação para isolar neutrófilos humanos do sangue total usando a mídia de separação disponíveis comercialmente.
Abstract
Neutrófilos granulócitos polimorfonucleares (PMN) são os leucócitos mais abundantes nos seres humanos e entre as primeiras células a chegar ao local da resposta imune inflamatória. Devido ao seu papel fundamental na inflamação, as funções de neutrófilos, como locomoção, produção de citocinas, fagocitose e combate de células tumorais são amplamente estudados. Para caracterizar as funções específicas de neutrófilos, um método limpo, rápido e confiável de separá-los de outras células sanguíneas é desejável para os estudos in vitro, especialmente desde que os neutrófilos têm vida curta e deve ser usado dentro de 2-4 horas após a coleta. Aqui, nós demonstramos um nível de densidade gradiente método de separação para isolar neutrófilos humanos a partir de sangue total utilizando a mídia separação comercialmente disponível que é uma mistura de sódio metrizoate e Dextran 500. O procedimento consiste de camadas de sangue toda a médio gradiente de densidade, a centrifugação, a separação da camada de neutrófilos, e lise de eritrócitos residual. Células são então lavados, contados, e ressuspenso em tampão de concentração desejada. Quando realizada corretamente, este método tem se mostrado a ceder amostras de neutrófilos> 95% com> viabilidade de 95%.
Protocol
Isolamento de neutrófilos Protocolo Trazer todos os reagentes à temperatura ambiente. Coletar 5,0 ml de meios de isolamento de neutrófilos no tubo de centrifugação. Cuidadosamente camada de 5,0 ml de sangue sobre a mídia separação. Realizar esta etapa lenta e cuidadosamente, e com a ponta da pipeta perto da superfície da mídia para evitar a mistura do sangue e da mídia. Centrifugar a 500 RCF por 35 min a 20-25 ° C. O sangue deve separar em 6 bandas distintas: plasma, monócitos…
Discussion
A densidade método de separação de gradiente é usado para isolar neutrófilos humanos a partir de sangue total utilizando uma mistura de sódio metrizoate e Dextran 500. Este método é baseado no método de separação de leucócitos mononucleares por Boyum (1968) que foi modificado para a separação de neutrófilos por Ferrante e Thong (1980).
Após a coleta de um doador, o sangue total pode ser anticoagulados com EDTA, citrato ou heparina. Uma vez que eles são de curta duração, os neutrófilos deve ser usado dentro de 2-4…
Acknowledgements
Financiamento do NIH R01 HL56621.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Lymphocyte Poly(R)
Reagent
Cedarlane Labs
PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride
Reagent
Invitrogen Gibco
Human Serum Albumin
Reagent
ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer
Reagent
Roche Diagnostics
Centrifuge
Tool
Vortexer
Tool
Pasteur Pipettes and bulb
Tool
PolymorphprepTM
Reagent
Axis-Shield PoC
Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter
Other
Millipore
SLGV033RS
Millex-GV, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride