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Biology

Aislamiento de neutrófilos Protocolo

doi: 10.3791/745 Published: July 23, 2008

Summary

Los neutrófilos se encuentran entre las primeras células en llegar al sitio de la respuesta inmune inflamatoria, y sus funciones y mecanismos han sido ampliamente estudiados in vitro. Se demuestra un gradiente de densidad estándar método de separación para aislar los neutrófilos humanos de sangre entera utilizando los medios disponibles en el mercado de separación.

Abstract

Granulocitos neutrófilos polimorfonucleares (PMN) son los leucocitos más abundantes en los seres humanos y entre las primeras células en llegar al sitio de la respuesta inmune inflamatoria. Debido a su papel clave en la inflamación, las funciones de los neutrófilos como la locomoción, la producción de citoquinas, fagocitosis, y combatir las células tumorales son ampliamente estudiados. Para la caracterización de las funciones específicas de los neutrófilos, un método limpio, rápido y confiable de que los separa de otras células sanguíneas es deseable que los estudios in vitro, sobre todo porque los neutrófilos son de corta duración y deben ser utilizados dentro de 2-4 horas de su recolección. Este sentido, demuestran un gradiente de densidad estándar método de separación para aislar los neutrófilos humanos de sangre entera utilizando los medios disponibles en el mercado de separación que es una mezcla de sodio y metrizoato Dextran 500. El procedimiento consiste en capas de sangre entera en el medio de gradiente de densidad, centrifugación, separación de la capa de neutrófilos, y la lisis de los eritrocitos residual. Las células se lavan, se cuentan y se resuspendieron en tampón de concentración que se desee. Cuando se realiza correctamente, este método ha demostrado que el rendimiento de las muestras de> 95% de neutrófilos con la viabilidad> 95%.

Protocol

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Aislamiento de neutrófilos Protocolo

  1. Mantener los reactivos a temperatura ambiente.
  2. Recoger 5,0 ml de medios de aislamiento de los neutrófilos en tubo de centrífuga. Cuidadosamente la capa de 5,0 ml de sangre sobre los medios de separación. Realizar este paso, lenta y cuidadosamente, y con la punta de la pipeta cerca de la superficie de los medios de comunicación para evitar la mezcla de la sangre y los medios de comunicación.
  3. Centrifugar a 500 RCF durante 35 minutos a 20-25 ° C. La sangre se debe separar en 6 secciones distintas: el plasma, los monocitos, los medios de aislamiento, los neutrófilos, más medios de aislamiento, y el pellet de glóbulos rojos (Figura 1). Si estas bandas no están claras, el proceso de separación no estaba limpia, y tendrá que ser repetido.
  4. Retire con cuidado la parte superior de tres capas (plasma, los monocitos, y los medios de aislamiento) con una pipeta. Disponer de estas capas.
  5. Pipeta cuidadosamente la capa de neutrófilos y todos los medios de aislamiento por debajo de los neutrófilos. Ponga la solución en un tubo de centrífuga limpio.
  6. Diluir la solución de los neutrófilos a 10 ml con HBSS sin Ca 2 + / Mg 2 +. Invertir el tubo varias veces para suspender las células.
  7. Centrifugar la solución de los neutrófilos a 350 RCF durante 10 minutos. Una pastilla de color rojo debe estar presente en la parte inferior del tubo, que contiene los neutrófilos y los residuos de glóbulos rojos (GR). Eliminar el sobrenadante con una pipeta con cuidado para que la pastilla no se altera.
  8. La lisis de los glóbulos rojos residual, agregar 2 ml Red tampón de lisis celular en el tubo. Para resuspender el precipitado y agitar el vial en un ajuste de 4.3. Evitar el aumento de la configuración de vórtice por encima de 4, ya que esto puede causar a los neutrófilos para activar. Puede que sea necesario para vórtice durante varios segundos, o "pulso" de la vorágine de disolver el precipitado.
  9. Centrifugar el tubo a 250 RCF durante 5 min. Eliminar el sobrenadante con una pipeta. Repita el proceso de lisis, si es necesario.
  10. Añadir 500 l HBSS sin Ca 2 + / Mg 2 + en cada tubo. Una vez más, vortex para resuspender el precipitado en un ajuste de 4.3. Diluir a 10 ml con HBSS sin Ca 2 + / Mg 2 +.
  11. Centrifugar los tubos a 250 RCF durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y desecharlo.
  12. Resuspender el precipitado en 250 HBSS l / Solución de HSA (2% HSA). Las células se pueden contar y se ajusta a la concentración deseada.

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Discussion

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El gradiente de densidad método de separación se utiliza para aislar los neutrófilos humanos de sangre total usando una mezcla de sodio y metrizoato Dextran 500. Este método se basa en el método de separación de leucocitos mononucleares por Boyum (1968), que fue modificada para la separación de los neutrófilos por Ferrante y Correa (1980).

Después de la recolección de un donante, la sangre entera pueden ser anticoagulados con EDTA, citrato o heparina. Ya que son de corta duración, los neutrófilos se debe utilizar dentro de 2-4 horas de su recolección. El procedimiento consiste en capas de sangre entera en el medio de gradiente de densidad, centrifugación, separación de la capa de neutrófilos, y la lisis de los eritrocitos residual. Las células se lavan, se cuentan y se resuspendieron a la concentración deseada.

Si los seis bandas no son distintas después de la primera centrifugación, el proceso de separación no estaba limpia, y tendrá que ser repetido. Para la separación limpia, asegúrese de que los medios de comunicación de aislamiento no ha expirado o están contaminados. La separación también puede no realizarse si el donante de sangre ha consumido alcohol o medicamentos en las 72 horas previas a la extracción de sangre.

Para evitar la activación de neutrófilos durante el proceso de separación, lo mejor es utilizar HBSS sin Ca2 + / Mg2 +, ya que los iones se ha demostrado que las células principales. Resuspensión de pellets también se debe realizar lentamente, y la configuración de vórtice debe mantenerse en el bajo y medio régimen para que las células no se activan.

Cuando se realiza correctamente, este método ha demostrado que el rendimiento de las muestras de> 95% de neutrófilos con la viabilidad> 95%. La pureza y la viabilidad puede ser evaluada por el etiquetado de las células con neutrófilos marcador específico CD66b y tripan exclusión del colorante azul.

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Acknowledgments

Financiación de los NIH R01 HL56621.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Poly(R) Reagent Cedarlane Labs PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride Reagent Invitrogen
Human Serum Albumin Reagent ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer Reagent Roche Group
Centrifuge Tool
Vortexer Tool
Pasteur Pipettes and bulb Tool
PolymorphprepTM Reagent Axis-Shield Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter Other EMD Millipore SLGV033RS Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride Reagent Invitrogen

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References

  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
Aislamiento de neutrófilos Protocolo
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Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).More

Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).

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