Dal MEF per Matrigel 3: hESC Passaging da Matrigel su Matrigel

Summary

Questo video dimostra come mantenere la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule di alimentazione priva di condizioni e modalità di continuo passaggio in hESC alimentatore cellulare senza condizioni. Conferma di hESC pluripotenza delle cellule coltivate in alimentatore senza condizioni al microscopio immunofluorescenza è anche dimostrata. Parte 3 di 3.

Abstract

Questo video dimostra come mantenere la crescita delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule di alimentazione priva di condizioni e modalità di continuo passaggio in hESC alimentatore cellulare senza condizioni. Conferma di hESC pluripotenza delle cellule coltivate in alimentatore senza condizioni al microscopio immunofluorescenza è anche dimostrata.

Protocol

HESC scissione da Matrigel a Matrigel

Di solito un confluenti 6 pozzetti di hESC su Matrigel possono essere divisi 1:03-01:05 ad un altro piatto Matrigel, con i pozzi di diventare confluenti ancora 4-5 giorni dopo la divisione.

1. CM e le piastre Matrigel sono preparati come descritto in precedenza prima di sciogliersi.
2. Il giorno della scissione, lavare i pozzetti per la scissione con 1 × PBS, pH7.4, aggiungere 1 ml di 1mg/ml dispasi (soluzione madre diluita 5mg/ml con DMEM/F12 media) in ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 3 min.
3. Lavare i pozzetti tre volte con 1 × PBS, pH7.4, aggiungere 1 ml di ES media senza bFGF, usare un raschietto colonie di cellule per raschiare dal fondo del pozzo, raccogliere le hESC sospeso in un tubo da 50 ml falco, e pellet per centrifugazione a 200g per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. Per ri-targhetta del hESC su piastre Matrigel, prima lavare i piatti con Matrigel DMEM/F12 e aggiungere 2,5 ml di CM integrata con 10ng/ml bFGF per bene. Risospendere il pellet in hESC un volume adeguato di CM integrata con 10ng/ml bFGF, pipetta la sospensione cellulare su e giù per tre volte. (NOTA: quando hESC per suddividere provengono da piastre Matrigel, le macchie sono molto facili da rompere, quindi tre cicli di pipettaggio è sufficiente e più pipettaggio può over-disturbare le colonie e fare singole cellule.) Aliquota 0,5 ml di sospensione hESC grumi per bene del 6-pozzetti Matrigel per ottenere 3 ml per oltre un volume finale. Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C.

Individuazione di marcatori di pluripotenza microscopia di immunofluorescenza

Microscopia a immunofluorescenza è utilizzato per esaminare l'espressione di marcatori hESC pluripotenza Oct-4 e SSE-4 durante la coltura.

1. Aspirare multimediali da un pozzetto e lavare con 1 × PBS, pH 7,4. Aggiungere 2 ml di 3,7% di formaldeide al pozzo di correzione per 10 min.
2. Risciacquare con 1xPBS, pH 7,4, aggiungere 2 ml di metanolo al pozzo e posto a -20 ° C per 2 min.
3. Risciacquare con 1xPBS, pH 7,4, e blocco con 1 ml di 0,2% serume albumina bovina (BSA) per 5 min.
4. Aggiungere 1 ml di anticorpo Oct-4 o anti-h/mSSEA-4 (1:200 diluizione nel 0,2% di BSA), e incubare a temperatura ambiente per 1 ora oppure a 4 ° C per una notte. (NOTA: per SSE-4 macchie, passare direttamente al punto 6)
5. Lavare tre volte con 1xPBS, pH 7,4, aggiungere FITC-coniugato IgG di coniglio (1:500 diluizione nel 0,2% di BSA), e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
6. Lavare 3 volte con 1xPBS, pH 7,4, e mettere una goccia di soluzione di montaggio (può contenere DAPI visualizzazione nucleare se si vuole) al centro del pozzo. Mettere coprioggetto sopra delle celle, sigillare con smalto, e valutare al microscopio immunofluorescenza.

Cellule staminali embrionali umane ricevute

ES media (mezzi di cellule staminali embrionali):

DMEM/F12 - 400ml
Knockout siero Replacer - 100ml
Aminoacidi non essenziali - 5ml
200mm GlutaMax / BME Solution - 5ml
Penicillina / streptomicina - 5ml

Mescolare bene e conservare finale Media Cultura hESC in bottiglie da 500ml a 4 ° C. Buono per un massimo di due settimane.

MEF Cultura Media:

DMEM - 1000ml
FBS - 100ml
Aminoacidi non essenziali - 10ml
Glutammina - 10ml
Penicllin / streptomicina - 10ml

Mescolare bene e conservare finale Media Cultura MEF a 4 ° C.

200mm Glutamax / BME Soluzione:

Glutamax - 100ml
β-mercaptoetanolo (Soluzione madre a 14,3 milioni) - 140 μ1
Mescolare due soluzioni bene e poi porzioni da 10 ml aliquota. Mantenere aliquote a -20 ° C.
bFGF Soluzione (concentrazione finale di magazzino: 10 microgrammi / ml):
bFGF (FGF2) - 50 mcg
BSA 0,1% nel 1xPBS, pH 7,4 - 5 ml

Sciogliere 50 microgrammi bFGF in 5ml BSA 0,1% per fare un 10 mcg / ml di brodo. Aliquotare in porzioni da 500 microlitri. Conservare a -80 ° C.

Collagenasi IV Soluzione (1mg/ml):

Collagenasi IV - 50mg
DMEM/F12 Media - 50ml

Aggiungere la polvere di collagenasi IV in una provetta da 50 ml falco. Nel cofano, mescolare in 50ml di sterili DMEM/F12 media. Vortex la soluzione per <1 min. per assicurarsi che la polvere è sciolta. Nel cofano, passare attraverso un filtro di 0,22 micron in un nuovo tubo sterile da 50ml falco. Questa soluzione è buona per un massimo di 2 settimane conservato a 4 ° C.

Dispasi Soluzione (1mg/ml):

Dispasi 5mg/ml - 2ml
Media DMEM/F12 - 8ml

Aliquota commerciale 5mg/ml soluzione dispasi e conservare a -20 ° C. Diluire dispasi a 1mg/ml utilizzando DMEM/F12. Questa soluzione può essere conservata per 1 settimana a 4 ° C.

Discussion

Questa serie di 3 video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) su fibroblasti embrionali di topo (MEF), le cellule di alimentazione (video 1), come passaggio a Matrigel cell-free alimentatore piastre (video 2), e come mantenere hESC da passaging in alimentatore Matrigel condizioni cell-free (video 3). Numerosi studi precedenti hanno mostrato che il mantenimento della vitali, hESC indifferenziato richiede cultura sulle cellule inattivate alimentatore MEF. Tuttavia, per molti esperimenti, una popolazione pura di hESC libero di contaminazione delle cellule alimentatore è richiesto. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo dimostrato come hESC passaggio dai piatti alimentatore MEF per alimentatore cell-free piastre Matrigel e come mantenere e continuamente colonie passaggio hESC alimentatore in condizioni cell-free. Seguendo questo protocollo, una piccola quantità di contaminazione delle cellule MEF alimentatore potrebbe ancora esistere uno al passaggio su un piatto Matrigel, ma questo contaminante è di solito facile da visualizzare. Al passaggio Matrigel due e oltre, nessuna contaminazione MEF si trova di solito, lasciando una popolazione pura di hESC per gli esperimenti. Immunofluorescenza e la citometria a flusso o microscopia per i marcatori hESC pluripotenza, come Oct-4 e SSE-4, sono necessari per confermare la manutenzione di hESC in uno stato indifferenziato durante cultura.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Knockout Serum Replacer (KSR)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828-028
DMEM/F12	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330-057
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140-050
GlutaMax	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	35050-061
DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11995-065
FBS	Reagent	Clontech Laboratories	631107
L-glutamine	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030-081
BME	Reagent	Fisher Scientific	BP176-100
bFGF	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Collagenase IV	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	17104-019
Dispase	Reagent	Stem Cell Technologies	17105-041
Penicillin / Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Gelatin	Reagent	Chemicon International	ES-006-B
Matrigel	Reagent	BD Biosciences	354277
Oct-4 antibody	Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9081
anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3	Reagent	R&D Systems	FAB1435P
FITCI-conjugated antirabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch	715-095-152