Summary
Bu video, besleyici, hücre koşullarda ve ne kadar besleyici sürekli geçit hESC hücre koşulları, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümesini nasıl koruyacağınızı gösteriyor. HESC, Onay pluripotency immünofloresan mikroskobu ile besleyici, hücre koşullarda yetiştirilen da gösterilmiştir. 3 Bölüm 3
Abstract
Bu video, besleyici, hücre koşullarda ve ne kadar besleyici sürekli geçit hESC hücre koşulları, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümesini nasıl koruyacağınızı gösteriyor. HESC, Onay pluripotency immünofloresan mikroskobu ile besleyici, hücre koşullarda yetiştirilen da gösterilmiştir.
Protocol
Matrigel Matrigel için Yarma hESC
Genellikle Matrigel üzerinde hESC bir konfluent 6 plaka, kuyu, yarma, 4-5 gün sonra tekrar konfluent olma, başka bir Matrigel plaka 1:5 için 1:3 bölünmüş olabilir.
- Yarma önce yukarıda açıklandığı gibi, CM ve Matrigel plakaları hazırlanır.
- Bölme gününde, × 1 ile bölme PBS, pH7.4 her iyi yıkayın iyi 1mg/ml Dispase (DMEM/F12 medya ile seyreltilmiş 5mg/ml stok solüsyonu) 1 ml ve 37 inkübe ° C 3 dk.
- 1 ile her iyi üç kez yıkayın × PBS, pH7.4,, ES medya, 1ml bFGF olmadan eklemek iyi alt kapalı koloniler kazımak için bir hücre kazıyıcı, 50ml şahin tüp askıya hESC toplamak ve santrifüj yoluyla pelet 200g oda sıcaklığında 5 dakika.
- Matrigel plakalar üzerinde yeniden plakalı hESC, ilk DMEM/F12 ile Matrigel tabak yıkama ve başına 10 ng bFGF ile desteklenmiş CM 2.5ml ekleyin. 10 ng bFGF, pipet hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı üç kez ile desteklenmiş CM uygun bir hacmi hESC pelletini tekrar. (NOT: yarma için hESC Matrigel plakaları geldiğinde, yığınları kırmak için çok kolay, bu nedenle üç tur pipetleme yeterli ve daha koloniler üzerinde bozabilir ve tek hücre yapabilir pipetleme.) Temsili miktar 0.5 ml ortalama hESC kümeleri süspansiyon 6-iyi Matrigel plaka nihai bir birim olarak ortalama 3ml ulaşmak için. 37 ° C inkübatör plaka koyun.
Immünofloresan mikroskopi pluripotency belirteçlerin saptanması
İmmünofloresan mikroskopi, kültür sırasında hESC pluripotency belirteçlerinin Ekim-4 ve SSEA-4 ifadesi incelemek için kullanılır.
- Iyi bir medya aspire ve 1 ile yıkayın × PBS, pH 7.4. 10 dakika düzeltmek için iyi,% 3.7 formaldehit 2ml ekle.
- 2 dakika süreyle iyi yer ve -20 ° C 2 ml metanol eklemek, 1xPBS pH 7.4 ile durulayın.
- 5 dakika süreyle% 0.2 sığır serume albumin (BSA) 1ml 1xPBS, pH 7.4 ve blok ile durulayın.
- Ekim-4 veya anti-h/mSSEA-4 antikor (% 0,2 BSA 1:200 dilüsyon) 1 ml ekleyin ve 1 saat veya 4 ° C'de gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. (NOT: SSEA-4 boyama, doğrudan 6. adıma gidin)
- 1xPBS, pH 7.4 ile üç kez durulayın FITC-konjuge tavşan IgG (% 0,2 BSA 1:500 dilüsyon), ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe ekleyin.
- 1xPBS, pH 7.4 ile 3 kez durulayın ve iyi merkezi montaj çözümü bir damla koymak (nükleer görselleştirme isteniyorsa DAPI içerebilir). Oje mühür, hücrelerin üstüne lamel koyun, ve immünofloresan mikroskobu ile değerlendirmek.
İnsan embriyonik kök hücre makbuzlar
ES medya (Embriyonik Kök hücre ortam):
DMEM/F12 - 400ml
Nakavt Serum Replacer - 100ml
Non-Essential Amino Asitler - 5ml
200mm GlutaMax / BME Çözüm - 5ml
Penisilin / Streptomisin - 5ml
4 iyice karıştırınız ve 500ml şişelerde son hESC Kültür Medya saklamak ° C En fazla bir iki hafta iyi.
MEF Kültür Medya:
DMEM - 1000ml
FBS - 100ml
Non-Essential Amino Asitler - 10ml
Glutamin - 10ml
Penicllin / Streptomisin - 10ml
İyice karıştırın ve 4 final MEF Kültür Medya saklamak ° C.
200mm Glutamax / BME Çözüm:
Glutamax - 100ml
β-mercaptoethanol (14.3M Stok çözelti) - 140 μ1
Iki ve sonra çözümler kısım 10ml bölümlerini karıştırın. -20 ° C'de alikotları tutun
bFGF Çözümü (stok nihai konsantrasyonu: 10 mikrogram / ml):
bFGF (FGF2) - 50 mikrogram
1xPBS% 0,1 BSA, pH: 7.4 - 5ml
10 mg / ml stok yapmak için 50 mikrogram olarak 5ml% 0.1 BSA bFGF eritin. 500 ul parçaya kısım. -80 ° C saklayınız
Kollajenaz IV Çözümü (1mg/ml):
Kollajenaz IV - 50mg
DMEM/F12 Medya - 50ml
50ml şahin tüp kollajenaz IV tozu ekleyin. Kaput, 50ml steril DMEM/F12 medya karıştırın. <1 dakika vorteksleyin çözüm. toz çözülmüş olduğundan emin olun. Kaputu, yeni bir steril 50ml şahin tüp içine filtresi 0.22 mikron geçmesi. Bu çözüm için iyi saklanan 2 hafta, 4 ° C maksimum
Dispase Çözüm (1mg/ml):
Dispase 5mg/ml - 2ml
DMEM/F12 Medya - 8 ml
-20 ° C'de kısım ticari, 5mg/ml Dispase çözüm ve mağaza DMEM/F12 kullanarak 1mg/ml dispase sulandırınız. Bu çözüm, 1 hafta, 4 tutulmalıdır ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu dizi 3 video (MEF) besleyici hücreler (video 1), geçit onları besleyici hücre-levhalar (Video 2) Matrigel nasıl ve ne kadar korumak için fare embriyonik fibroblast insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümeye nasıl gösterir Matrigel besleyici hücre koşulları (video 3) Pasajlanması hESC. Birçok önceki çalışmalar, bu bakım yaşayabilir, farklılaşmamış hESC inaktive MEF besleyici hücreler kültür gerektirir gösterdi. Ancak, pek çok deney, besleyici hücre kontaminasyon ücretsiz hESC saf bir nüfus gerekmektedir. Bu amaca ulaşmak için, biz nasıl geçit hESC MEF besleyici plakaları besleyici hücre ücretsiz Matrigel plakaları ve nasıl korumak ve besleyici sürekli geçit hESC kolonilerin hücre koşullarda göstermiştir. MEF besleyici hücre kontaminasyon bu protokolü takip ederek, küçük bir miktar hala bir Matrigel plaka üzerinde geçiş birine de var olabileceği, ancak bu kirletici genellikle görselleştirmek için kolaydır. Matrigel geçit iki ötesinde, hiçbir MEF kirlenme genellikle deneyler için saf bir nüfus hESC bırakarak bulundu. Ekim-4 ve SSEA-4, hESC pluripotency belirteçleri, immünofloresan boyaması ve mikroskobu veya flow sitometri sırasında farklılaşmamış bir kültür devlet hESC bakım onaylamak için ihtiyaç vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Teitell laboratuar İnsan embriyonik kök hücre çalışmaları California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) tohum hibe RS1-00313 tarafından desteklenmektedir. Geniş, UCLA, özellikle Dr. Amander Clark, Dr Jerome Zack ve verdikleri destek için çalışmalarımız UCLA Broad Enstitüsü Kök Hücre Çekirdek Tesis üyeleri Rejeneratif Tıp ve Kök Hücre Araştırma Merkezi üyelerine teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
