Summary
このビデオでは、フィーダー細胞を含まない条件とどのように継続的にフィーダー細胞を含まない条件で継代ヒトESにおけるヒト胚性幹細胞（ヒトES）の成長を維持する方法を示します。免疫蛍光顕微鏡法でフィーダー細胞を含まない条件で増殖させた多能性hESCの確認にも示されている。 3のパート3。
Abstract
このビデオでは、フィーダー細胞を含まない条件とどのように継続的にフィーダー細胞を含まない条件で継代ヒトESにおけるヒト胚性幹細胞（ヒトES）の成長を維持する方法を示します。免疫蛍光顕微鏡法でフィーダー細胞を含まない条件で増殖させた多能性hESCの確認にも示されている。
Protocol
マトリゲルからマトリゲルへの分割ヒトES細胞
通常、マトリゲル上でヒトES細胞のコンフルエント6ウェルプレートのウェルに4-5日を分割した後、再びコンフルエントになると、別のマトリゲルプレートは1:5〜1:3に分割することができます。
- CMとマトリゲルプレートは分割前に上記のように調製されています。
- 分割の日に、、× 1で分割するためにPBS、pH7.4のを各ウェルを洗浄を各ウェルに1mg/mlディスパーゼ（DMEM/F12媒体で希釈5mg/mlストック溶液）1mlのを追加し、37℃ 3分間。
- bFGFをせずにESのメディアの1ミリリットルを追加、1 × PBS、pH7.4の各ウェル3回洗浄し、ウェルの底からコロニーをこすり取る際には、セルスクレーパーを使用し、遠心分離して50ミリリットルファルコンチューブ、そしてペレットに懸濁したヒトES細胞を収集する200グラムで、室温で5分間。
- マトリゲルプレート上でヒトES細胞の再プレートには、まずDMEM/F12でマトリゲルプレートを洗浄し、ウェルあたり10ng/mlのbFGFを添加したCMの2.5ミリリットルを追加。 10ng/ml bFGFを、ピペット細胞懸濁液を上下に三回補充したCMの適切な量でヒトES細胞ペレットを再懸濁する。 （注：分割のためのヒトES細胞は、マトリゲル板から来ると、塊は破壊することは非常に容易であるためピペッティングの三回で十分ですし、より多くのコロニーを介して、混乱して単一細胞を作ることがピペッティング。）アリコートあたりのhESCの塊の懸濁液の0.5mlも最終的なボリュームとして、ウェル当たり3ミリリットルを達成するために6ウェルマトリゲルプレートの。 37℃インキュベーターでプレートを置きます。
免疫蛍光顕微鏡による多分化能マーカーの検出
免疫蛍光顕微鏡は、培養中のヒトES細胞分化能マーカーOCT - 4およびSSEA - 4の発現を調べるために使用されます。
- よくいずれかから培地を吸引除去し、1 × PBS、pH7.4で洗浄。 10分間固定するウェルに3.7％ホルムアルデヒドの2ミリリットルを追加。
- 2分間-20よくと場所° Cに2ミリリットルのメタノールを追加、1xPBS、pH7.4ですすいでください。
- 5分間（BSA）アルブミン0.2％ウシserume 1mlので1xPBS、pH7.4の、そしてブロックですすいでください。
- OCT - 4またはanti-h/mSSEA-4抗体（0.2％BSAで1:200に希釈）の1mlを追加し、1時間または4℃で一晩室温でインキュベートする。 （注：SSEA - 4染色のために、手順6に直接移動）
- 、1xPBS、pH7.4で三回すすぎFITC結合ウサギIgG（0.2％BSAで1:500希釈）、および1時間室温でインキュベートする。
- 1xPBS、pH7.4で3回リンスし、ウェルの中央に（核の可視化が望まれているなら、DAPIを含むことができます）取付溶液の液滴を置く。マニキュアで密封する、細胞の上にカバースリップを置き、免疫蛍光顕微鏡で評価する。
ヒト胚性幹細胞の領収書
ESメディア（胚性幹細胞メディア）：
DMEM/F12 - 400ミリリットル
ノックアウト血清代替品配合 - 100ml
非必須アミノ酸 - 5ミリリットル
200mmのグルタミン/ BMEソリューション - 5ミリリットル
ペニシリン/ストレプトマイシン - 5ミリリットル
よく混和して、4で500ミリリットル瓶で、最終的なhESCの文化メディア℃にて保存してください。二週間の最高に良い。
MEF文化メディア：
DMEM - 千ミリリットル
FBS配合 - 100ml
非必須アミノ酸 - 10ミリリットル
グルタミン - 10ミリリットル
Penicllin /ストレプトマイシン - 10ミリリットル
よく混和して、4で最後のMEFの文化メディア℃にて保存してください。
200mmのグルタミン/ BMEソリューション：
グルタミン配合 - 100ml
β-メルカプトエタノール（14.3Mでストック溶液） - 140μ1
うまく2つのソリューションをミックスし、アリコート10mlの部分。 -20℃でアリコートを保つ
bFGFのソリューション（株式の最終濃度：10マイクログラム/ ml）：
bFGFの（FGF2） - 50μgの
1xPBSの0.1％BSA、pHは7.4〜5ミリリットル
10μg/ mlのストックを作るために5ミリリットル、0.1％BSAのbFGF 50マイクログラムを溶かす。 500μlの部分に分注し。 -80℃で保存する
コラゲナーゼIV溶液（1mg/ml）：
コラゲナーゼIV - 50mgの
DMEM/F12メディア - 50ミリリットル
50ミリリットルファルコンチューブにコラゲナーゼIVパウダーを追加。フードでは、無菌DMEM/F12メディア50mlので混ぜる。 <1分間ボルテックスソリューション。粉体が溶解されていることを確認する。フードでは、新しい滅菌50ミリリットルファルコンチューブに0.22μmのフィルターを通過します。このソリューションは、4℃で保存されて2週間℃の最高に良いです。
ディスパーゼ溶液（1mg/ml）：
ディスパーゼ5mg/ml - 2ミリリットル
DMEM/F12メディア - 8ミリリットル
-20℃で分注し、商業5mg/mlのディスパーゼのソリューションとストアDMEM/F12を使用して1mg/mlにディスパーゼを希釈する。この溶液を4℃で1週間のために保持することができます
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Discussion
3つ作品のこのシリーズは、どのように通過それらのフィーダー細胞フリープレート（ビデオ2）、およびどのように維持することをマトリゲルために、マウス胚性線維芽細胞（MEF）フィーダー細胞（ビデオ1）にヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）を成長する方法を示していますマトリゲルフィーダー細胞を含まない条件（ビデオ3）に継代してヒトES細胞。数多くの先行研究では、実行可能な、未分化ヒトES細胞の維持は不活化MEFフィーダー細胞上で培養を必要とすることを示した。しかし、多くの実験のために、フィーダー細胞のコンタミネーションの自由なヒトES細胞の純粋な人口が必要です。この目標を達成するために、我々はどのようにMEFフィーダープレートからのフィーダー細胞を含まないマトリゲルプレートとどのようにフィーダー細胞を含まない条件で継代ヒトES細胞のコロニーを維持し、継続的にへの通路のヒトESに示されている。このプロトコルに従うことで、MEFフィーダー細胞のコンタミネーションの少量はまだマトリゲルプレート上で継代つで存在するものの、この汚染物質は、通常、可視化することは簡単です。マトリゲル通路2時以降、何MEFの汚染は、通常の実験のためのヒトES細胞の純粋な集団を残して、発見されていません。このようなOCT - 4およびSSEA - 4、などのhESCの多能性マーカー、のための免疫蛍光染色し、顕微鏡またはフローサイトメトリーは、培養中の未分化状態のヒトES細胞の維持を確認するために必要です。
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Acknowledgments
Teitellラボでヒト胚性幹細胞研究は再生医療のためのカリフォルニア工科大学（CIRM）種子助成RS1 - 00313でサポートされています。我々は、UCLA、特に博士Amanderクラーク博士ジェロームザック、そして我々の研究の支援のためのUCLAのブロード研究所の幹細胞の中核施設のメンバーで、再生医療と幹細胞研究のブロードセンターのメンバーに感謝。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
