Summary
В этом видеоролике показано, как поддержать рост человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в фидер бесклеточных условиях и как непрерывно прохождения ЭСК в питатель бесклеточных условиях. Подтверждение чЭСК плюрипотентности, выращенные в питатель бесклеточных условиях с помощью иммунофлуоресценции микроскопии также продемонстрирована. Часть 3 из 3.
Abstract
В этом видеоролике показано, как поддержать рост человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в фидер бесклеточных условиях и как непрерывно прохождения ЭСК в питатель бесклеточных условиях. Подтверждение чЭСК плюрипотентности, выращенные в питатель бесклеточных условиях с помощью иммунофлуоресценции микроскопии также продемонстрирована.
Protocol
Разделение ЭСК из Матригель к Матригель
Обычно сливной 6-луночный планшет из ЭСК на Матригель можно разделить 1:3 до 1:5 до другого Матригель табличка со скважин становится вырожденным снова через 4-5 дней после расщепления.
- CM и Матригель пластин приготовленного, как описано выше, до расщепления.
- В день расщепления, мыть каждую лунку для расщепления с 1 х PBS, pH7.4, добавьте 1 мл 1mg/ml Dispase (разбавленный 5mg/ml маточного раствора с DMEM/F12 средств массовой информации) в каждую лунку и инкубировать при температуре 37 ° C в течение 3 мин.
- Промыть каждую лунку три раза с 1 х PBS, pH7.4, добавьте 1 мл ES СМИ без bFGF, с помощью мобильного скребок, чтобы очистить колонии со дна колодца, собирать приостановлено ЭСК в 50 мл трубки сокола, и гранул путем центрифугирования на 200 г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Для повторного пластины ЭСК на пластинах Матригель, первой стирки Матригель пластин с DMEM/F12 и добавить 2,5 мл СМ дополнена 10ng/ml bFGF на лунку. Ресуспендируют чЭСК пеллет в соответствующий объем СМ дополнена 10ng/ml bFGF, пипетка клеточной суспензии вверх и вниз три раза. (ПРИМЕЧАНИЕ: При ЭСК для расщепления происходят из Матригель пластин, сгустки очень легко сломать, поэтому три раунда пипетирования достаточно и больше пипетки может чрезмерно нарушить колоний и сделать отдельные клетки.) Алиготе 0,5 мл чЭСК сгустки суспензии в а из 6-луночный планшет Матригель для достижения 3 мл на лунку, как конечного объема. Место пластины в 37 ° С инкубатор.
Обнаружение маркеров плюрипотентности помощью иммунофлуоресценции микроскопии
Иммунофлуоресценции микроскопии для изучения экспрессии маркеров плюрипотентности чЭСК Oct-4 и SSEA-4 во время культивирования.
- Аспирируйте средств массовой информации из одной ямы и промыть 1 х PBS, рН 7,4. Добавить 2 мл 3,7% формальдегид и зафиксировать в течение 10 мин.
- Промыть 1xPBS, рН 7,4, добавляют 2 мл метанола к колодцу и место при температуре -20 ° С в течение 2 мин.
- Промыть 1xPBS, рН 7,4, а блок с 1 мл 0,2% бычьего serume альбумина (БСА) в течение 5 мин.
- Добавить 1 мл Oct-4 или anti-h/mSSEA-4 антител (1:200 разведения в 0,2% BSA), и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч или при температуре 4 ° С в течение ночи. (ПРИМЕЧАНИЕ: для SSEA-4 окрашивания, перейти к пункту 6)
- Промыть трижды 1xPBS, рН 7,4, добавляют FITC-сопряженных кролика IgG (1:500 разведения в 0,2% BSA), и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Промыть 3 раза 1xPBS, рН 7,4, и поместить каплю решение для монтажа (может содержать DAPI если ядерная визуализация желанию) в центре хорошо. Положите покровное на вершине клетки, печать с лаком для ногтей, а также оценить с помощью иммунофлуоресценции микроскопии.
Человека эмбриональных стволовых клеток поступлений
ES СМИ (средств массовой информации эмбриональных стволовых клеток):
DMEM/F12 - 400 мл
Нокаут сыворотки Replacer - 100мл
Номера для незаменимых аминокислот - 5 мл
200 мМ GlutaMax / BME раствор - 5 мл
Пенициллин / стрептомицин - 5 мл
Хорошо перемешайте и храните окончательный медиа-культуры чЭСК в 500 мл бутылки при температуре 4 ° C. Хорошо для не более двух недель.
MEF Культура СМИ:
DMEM - 1000 мл
FBS - 100 мл
Номера для незаменимых аминокислот - 10 мл
Глютамин - 10мл
Penicllin / стрептомицин - 10 мл
Хорошо перемешайте и храните окончательный медиа-культуры MEF при 4 ° C.
200 мМ Glutamax / BME Решение:
Glutamax - 100мл
β-меркаптоэтанол (Stock решение в 14.3M) - 140 μ1
Смешайте два решения хорошо, а затем часть аликвоту 10 мл. Держите аликвоты при -20 ° C.
bFGF Решение (конечная концентрация складе: 10 мкг / мл):
bFGF (FGF2) - 50 мкг
0,1% BSA в 1xPBS, рН 7,4 - 5 мл
Растворите 50 мкг bFGF в 5 мл 0,1% БСА, чтобы сделать 10 мкг / мл состава. Алиготе в 500 мкл порции. Хранить при температуре -80 ° C.
Коллагеназы IV Решение (1mg/ml):
Коллагеназы IV - 50 мг
DMEM/F12 СМИ - 50 мл
Добавить порошок коллагеназы IV в 50 мл трубки сокола. В капот, смешать в 50 мл стерильного DMEM/F12 СМИ. Vortex решение для <1 мин. чтобы убедиться, что порошок не растворится. В капот, проходят через 0,22 мкм фильтр в новые стерильные 50 мл трубки сокола. Это решение хорошо для не более 2 недель хранили при 4 ° C.
Dispase Решение (1mg/ml):
Dispase 5mg/ml - 2 мл
DMEM/F12 СМИ - 8 мл
Алиготе коммерческих Dispase 5mg/ml решение и хранить при температуре -20 ° C. Развести dispase к 1mg/ml использованием DMEM/F12. Это решение может храниться в течение 1 недели при температуре 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта серия 3 видео демонстрирует, как выращивать человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) фидерных клеток (видео 1), как прохождение их Матригель подачи бесклеточной пластин (видео 2), и как поддерживать ЭСК путем пассажей в Матригель подачи бесклеточных условиях (видео 3). Многочисленные предыдущие исследования показали, что поддержание жизнеспособных, недифференцированные ЭСК требует культуры на инактивированной фидерные клетки MEF. Однако для многих экспериментов, чистая населения ЭСК без подачи загрязнения ячейки не требуется. Для достижения этой цели, мы продемонстрировали, как проход ЭСК из плит MEF питатель для подачи бесклеточной пластин Матригель и как поддерживать и непрерывно прохождения чЭСК колоний в питатель бесклеточных условиях. Следуя этому протоколу, небольшое количество MEF загрязнения ячейки подачи все еще может существовать при прохождении один на пластине Матригель, но это загрязняющее вещество обычно легко визуализировать. На Матригель прохождение двух и за его пределами, не загрязняются MEF обычно находится, в результате чего чистый населения ЭСК для экспериментов. Иммунофлуоресцентного метода и микроскопии или проточной цитометрии для чЭСК плюрипотентности маркеров, таких как Oct-4 и SSEA-4, необходимы, чтобы подтвердить поддержания ЭСК в недифференцированном состоянии во время культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Человека эмбриональных стволовых клеток исследований в лаборатории Teitell поддерживаются Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) семена грант RS1-00313. Мы благодарим членов Широкий Центр регенеративной медицины и исследований стволовых клеток в Лос-Анджелесе, особенно доктор Amander Кларк, д-р Джером Зак, и члены UCLA Broad Institute стволовых клеток Основные фонда за поддержку наших исследований.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
