Summary
Denna video visar hur att upprätthålla tillväxten av stamceller från mänskliga embryon (hESCs) i mataren cellfria villkor och hur man kontinuerligt passage hESCs i mataren cellfria förhållanden. Bekräftelse av hESC pluripotens odlas i mataren cellfria förhållanden genom immunofluorescens mikroskopi är också påvisas. Del 3 av 3.
Abstract
Denna video visar hur att upprätthålla tillväxten av stamceller från mänskliga embryon (hESCs) i mataren cellfria villkor och hur man kontinuerligt passage hESCs i mataren cellfria förhållanden. Bekräftelse av hESC pluripotens odlas i mataren cellfria förhållanden genom immunofluorescens mikroskopi är också påvisas.
Protocol
Delning hESCs från Matrigel till Matrigel
Vanligtvis en sammanhängande 6-brunnar i hESCs på Matrigel kan delas 1:03 till 01:05 till en annan Matrigel tallrik, med brunnarna blir konfluenta igen 4-5 dagar efter klyvning.
- CM och Matrigel plattor är beredd enligt ovan innan du delar.
- På dagen för att dela, tvätta varje brunn för att dela med 1 × PBS, pH7.4, tillsätt 1 ml 1mg/ml Dispase (utspädd 5mg/ml stamlösning med DMEM/F12 medier) till varje brunn och inkubera vid 37 ° C i 3 min.
- Tvätta varje brunn tre gånger med 1 × PBS, pH7.4, tillsätt 1 ml ES media utan bFGF, använd en cell skrapa för att skrapa kolonier från botten av brunnen, samla in den avstängda hESCs i en 50ml falk rör och pellets genom centrifugering vid 200g i 5 min vid rumstemperatur.
- För att åter-platta i hESCs på Matrigel tallrikar, först tvätta Matrigel tallrikar med DMEM/F12 och tillsätt 2,5 ml av CM kompletteras med 10ng/ml bFGF per brunn. Resuspendera hESC pelleten i en lämplig volym av CM kompletteras med 10ng/ml bFGF, pipett cellsuspensionen upp och ner tre gånger. (OBS: När hESCs för delning kommer från Matrigel tallrikar, den klumpar är mycket lätt att bryta, därför tre rundor av pipettering räcker och mer pipettering kan över-störa kolonierna och göra enstaka celler.) Alikvotera 0,5 ml hESC klumpar fjädring per väl i 6-väl Matrigel platta för att uppnå 3ml per samt en slutlig volym. Placera plattan i ett 37 ° C inkubator.
Upptäckt av pluripotens markörer genom immunofluorescens mikroskopi
Immunofluorescensmikroskopi används för att undersöka uttrycket av hESC pluripotens markörer oktober-4 och SSEA-4 under odling.
- Aspirera media från en brunn och tvätta med 1 × PBS, pH 7,4. Tillsätt 2 ml 3,7% formaldehyd till brunnen för att fixa i 10 min.
- Skölj med 1xPBS, pH 7,4, lägg till 2 ml metanol till brunnen och placera vid -20 ° C i 2 min.
- Skölj med 1xPBS, pH 7,4, och blockera med 1 ml 0,2% bovint serume albumin (BSA) i 5 minuter.
- Tillsätt 1 ml oktober-4 eller anti-h/mSSEA-4 antikropp (1:200 spädning i 0,2% BSA) och inkubera i rumstemperatur i 1 h eller vid 4 ° C över natten. (OBS: för SSEA-4 färgning, gå direkt till steg 6)
- Skölj tre gånger med 1xPBS, pH 7,4, lägg FITC-konjugerat kanin-IgG (1:500 spädning i 0,2% BSA) och inkubera i rumstemperatur i 1 timme.
- Skölj tre gånger med 1xPBS, pH 7,4, och sätta en droppe monteringslösning (kan innehålla DAPI om kärnkraft visualisering önskas) i centrum av brunnen. Sätt täckglas på toppen av celler, tätning med nagellack, och utvärdera genom immunofluorescens mikroskopi.
Mänskliga embryonala stamceller kvitton
ES media (embryonala stamceller media):
DMEM/F12 - 400ml
Knockout Serum Replacer - 100ml
Icke-essentiella aminosyror - 5ml
200mm GlutaMax / BME Solution - 5ml
Penicillin / streptomycin - 5ml
Blanda väl och förvara sista Media hESC kultur i 500ml flaskor vid 4 ° C. Bra för högst två veckor.
MEF Kultur Media:
DMEM - 1000ml
FBS - 100ml
Icke-essentiella aminosyror - 10ml
Glutamin - 10ml
Penicllin / streptomycin - 10ml
Blanda väl och förvara sista Media MEF kultur vid 4 ° C.
200mm Glutamax / BME Lösning:
Glutamax - 100ml
β-merkaptoetanol (Stamlösning på 14.3M) - 140 μ1
Blanda två lösningar väl och sedan alikvoter 10ml. Håll alikvoter vid -20 ° C.
bFGF Lösning (slutlig koncentration av lager: 10 mikrogram / ml):
bFGF (FGF2) - 50 mikrogram
0,1% BSA i 1xPBS, pH 7,4 - 5ml
Lös upp 50 mikrogram bFGF i 5 ml 0,1% BSA för att göra en 10 mikrogram / ml lager. Alikvotera till 500 l portioner. Förvaras vid -80 ° C.
Kollagenas IV Solution (1mg/ml):
Kollagenas IV - 50 mg
DMEM/F12 Media - 50ml
Tillsätt kollagenas IV pulver till en 50 ml falk rör. I huven, blanda i 50 ml sterilt DMEM/F12 medier. Vortexa lösningen för <1 min. att se till att pulvret är upplöst. I huven, passerar genom en 0,22 ìm filter till en ny steril 50 ml falk rör. Denna lösning är bra för högst 2 veckor lagras vid 4 ° C.
Dispase Solution (1mg/ml):
Dispase 5mg/ml - 2ml
DMEM/F12 Media - 8ml
Alikvotera kommersiella 5mg/ml Dispase lösning och förvara vid -20 ° C. Späd dispase till 1mg/ml med DMEM/F12. Denna lösning kan förvaras i 1 vecka vid 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna serie av tre filmer visar hur man odlar stamceller från mänskliga embryon (hESCs) på musens embryonala fibroblaster (MEF) feeder celler (video 1), hur man passagen dem att Matrigel feeder cellfria plattor (video 2) och hur man underhåller hESCs av passaging i Matrigel mataren cellfria villkor (video 3). Ett flertal tidigare studier visade att underhåll av livskraftiga, odifferentierad hESCs kräver kultur på inaktiverade celler MEF matare. Men för många experiment, är en ren population av hESCs gratis feeder cell föroreningar krävs. För att uppnå detta mål har vi visat hur passagen hESCs från MEF matare plattorna feeder cellfria Matrigel plattor och hur man kan upprätthålla och kontinuerligt passage kolonier hESC i mataren cellfria förhållanden. Genom att följa detta protokoll, kan en liten mängd MEF feeder cell föroreningar finns kvar vid passage en på en Matrigel tallrik, men det främmande är oftast lätt att visualisera. På Matrigel passage två och därefter, finns ingen MEF kontamination brukar finnas, vilket ger en ren population av hESCs för experiment. Immunofluorescens färgning och mikroskopi eller flödescytometri för hESC pluripotens markörer, såsom oktober-4 och SSEA-4, behövs för att bekräfta underhåll av hESCs i en odifferentierad tillstånd under kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Mänskliga embryonala stamceller studier i Teitell labbet stöds av en California Institute för regenerativ medicin (CIRM) frö bevilja RS1-00.313. Vi tackar medlemmar i de allmänna Centrum för regenerativ medicin och stamcellsforskning vid UCLA, speciellt Dr Amander Clark, Dr Jerome Zack, och medlemmar av UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility för deras stöd för våra studier.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
