De FAE au Matrigel 3: Le repiquage du Matrigel CSEh sur Matrigel

Summary

Cette vidéo montre comment maintenir la croissance de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) dans le chargeur sans cellules conditions et la manière de CSEh passage en continu dans le chargeur sans cellules conditions. Confirmation de CSEh pluripotence grandi dans le chargeur sans cellules par microscopie d'immunofluorescence conditions est également démontrée.

Abstract

Cette vidéo montre comment maintenir la croissance de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) dans le chargeur sans cellules conditions et la manière de CSEh passage en continu dans le chargeur sans cellules conditions. Confirmation de CSEh pluripotence grandi dans le chargeur sans cellules par microscopie d'immunofluorescence conditions est également démontrée.

Protocol

Fractionnement du Matrigel CSEh au Matrigel

Habituellement, un confluentes 6-même assiette de CSEh sur Matrigel peut être divisé 1:03-1:05 à une autre plaque de Matrigel, les puits deviennent confluentes à nouveau 4-5 jours après fractionnement.

1. CM et plaques Matrigel sont préparés comme décrit ci-dessus avant de se séparer.
2. Le jour de fractionnement, se laver chaque puits pour le fractionnement avec 1 x PBS, pH 7,4, ajoutez 1 ml de 1mg/ml dispase (une solution diluée d'actions 5mg/ml avec DMEM/F12 médias) dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 3 min.
3. Laver chaque puits trois fois avec 1 x PBS, pH 7,4, ajoutez 1 ml d'ES médias sans bFGF, utiliser un grattoir à cellules de gratter les colonies du fond du puits, de recueillir les CSEh en suspension dans un tube de 50ml Falcon, et par centrifugation à 200g pendant 5 min à température ambiante.
4. Pour ré-plaque de l'CSEh sur des plaques de Matrigel, d'abord laver les assiettes avec Matrigel DMEM/F12 et ajouter 2,5 ml de CM complétée par 10ng/ml bFGF par puits. Reprendre le culot de CSEh dans un volume approprié de CM complété avec 10ng/ml bFGF, une pipette la suspension cellulaire de haut en bas trois fois. (REMARQUE: Lorsque les CSEh au fractionnement proviennent de plaques de Matrigel, les massifs sont très faciles à casser, donc trois séries de pipetage est assez et plus de pipetage peut perturber le cours-colonies et de faire des cellules individuelles.) Aliquote de 0,5 ml de suspension par des touffes de CSEh puits de la plaque de 6 puits Matrigel pour atteindre 3ml ainsi que par un volume final. Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C.

Détection des marqueurs de pluripotence par immunofluorescence

Immunofluorescence est utilisée pour examiner l'expression des marqueurs de pluripotence des CSEh Oct-4, SSEA-4 en cours de culture.

1. Aspirer les médias d'un puits et laver avec 1 x PBS, pH 7,4. Ajouter 2 ml de formaldéhyde de 3,7% pour le bien de fixer pendant 10 min.
2. Rincer à l'1xPBS, pH 7,4, ajouter 2 ml de méthanol pour le bien et le lieu à -20 ° C pendant 2 min.
3. Rincer à l'1xPBS, pH 7,4, et bloquer avec 1ml de serume bovin à 0,2% d'albumine (BSA) pendant 5 min.
4. Ajouter 1 ml d'anticorps de Oct-4 ou anti-h/mSSEA-4 (1:200 dilution dans 0,2% de BSA), et incuber à température ambiante pendant 1 heure ou à 4 ° C pendant la nuit. (REMARQUE: pour SSEA-4 taches, passez directement à l'étape 6)
5. Rincer trois fois avec 1xPBS, pH 7,4, ajoutez-FITC conjugué IgG de lapin (1:500 dilution dans 0,2% de BSA), et incuber à température ambiante pendant 1 heure.
6. Rincer 3 fois avec 1xPBS, pH 7,4, et de mettre une goutte de solution de montage (peut contenir DAPI, si la visualisation nucléaire est souhaitée) au centre du puits. Mettez la lamelle sur le dessus des cellules, sceller avec du vernis à ongles, et d'évaluer par microscopie d'immunofluorescence.

Embryonnaires humaines reçus de cellules souches

ES médias (cellules souches embryonnaires):

DMEM/F12 - 400ml
Knockout Sérum Replacer - 100ml
Non-acides aminés essentiels - 5ml
200 mM glutamax / BME Solution - 5ml
Pénicilline / streptomycine - 5ml

Mélangez bien et stocker finale Médias Culture CSEh dans des bouteilles de 500ml à 4 ° C. Bon pour un maximum de deux semaines.

Culture MEF médias:

DMEM - 1000ml
FBS - 100ml
Non-acides aminés essentiels - 10ml
Glutamine - 10ml
Penicllin / Streptomycine - 10ml

Mélangez bien et stocker finale Médias Culture MEF à 4 ° C.

200 mM Glutamax / BME Solution:

Glutamax - 100ml
β-mercaptoéthanol (solution stock à 14,3) - 140 μ1
Mélangez deux solutions bien et puis des portions de 10ml aliquote. Gardez aliquotes à -20 ° C.
bFGF solution (concentration finale de stock: 10 microgrammes / ml):
bFGF (FGF2) - 50 mg
0,1% de BSA dans les 1xPBS, pH 7,4 - 5 ml

Dissoudre 50 microgrammes de bFGF dans 0,1% de BSA 5ml de faire un 10 ug / ml stock. Aliquoter en portions de 500 ul. Conserver à -80 ° C.

Collagénase IV Solution (1mg/ml):

Collagénase IV - 50mg
DMEM/F12 Médias - 50ml

Ajouter la poudre de collagénase IV à un tube de 50ml Falcon. Dans la hotte, mélanger dans 50ml de stériles DMEM/F12 médias. Vortex la solution pour <1 min. pour s'assurer que la poudre soit dissoute. Dans la hotte, passer par un filtre de 0,22 um dans un nouveau tube 50ml stérile faucon. Cette solution est bonne pour un maximum de 2 semaines à 4 ° C.

Dispase Solution (1mg/ml):

Dispase 5mg/ml - 2ml
Médias DMEM/F12 - 8ml

Aliquoter solution commerciale Dispase 5mg/ml et conserver à -20 ° C. Diluer dispase à 1mg/ml utilisant DMEM/F12. Cette solution peut être conservée pendant 1 semaine à 4 ° C.

Discussion

Cette série de 3 vidéos démontre comment faire pousser des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sur fibroblastes de souris embryonnaires des cellules nourricières (MEF) (vidéo 1), comment les passage à Matrigel sans cellule d'alimentation des plaques (vidéo 2), et comment maintenir CSEh par passage dans le chargeur Matrigel sans cellules conditions (vidéo 3). De nombreuses études antérieures ont montré que l'entretien de viable, CSEh indifférenciées nécessite la culture sur cellules nourricières inactivées MEF. Cependant, pour de nombreuses expériences, une population pure de CSEh libre de toute contamination de cellules nourricières est nécessaire. Pour atteindre cet objectif, nous avons démontré comment les CSEh passage de plaques d'alimentation au chargeur de pile MEF plaques sans Matrigel et la façon de maintenir et de façon continue des colonies de CSEh passage dans le chargeur conditions acellulaires. En suivant ce protocole, une petite quantité de contamination de cellules nourricières MEF pourrait encore exister au passage de l'un sur une plaque de Matrigel, mais ce contaminant est généralement facile à visualiser. Au passage de Matrigel deux et au-delà, aucune contamination du MEF se trouve généralement, laissant une population pure de CSEh pour des expériences. Immunofluorescence et cytométrie de flux pour microscopie ou marqueurs de pluripotence des CSEh, tels que Oct-4, SSEA-4, sont nécessaires pour confirmer l'entretien des CSEh dans un état indifférencié pendant la culture.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Knockout Serum Replacer (KSR)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828-028
DMEM/F12	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330-057
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140-050
GlutaMax	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	35050-061
DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11995-065
FBS	Reagent	Clontech Laboratories	631107
L-glutamine	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030-081
BME	Reagent	Fisher Scientific	BP176-100
bFGF	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Collagenase IV	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	17104-019
Dispase	Reagent	Stem Cell Technologies	17105-041
Penicillin / Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Gelatin	Reagent	Chemicon International	ES-006-B
Matrigel	Reagent	BD Biosciences	354277
Oct-4 antibody	Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9081
anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3	Reagent	R&D Systems	FAB1435P
FITCI-conjugated antirabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch	715-095-152