Summary
本视频演示了如何维持人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）在馈线无细胞的条件和如何在馈线不断通过人类胚胎干细胞的无细胞条件的增长。在馈线无细胞的条件下，免疫荧光显微镜确认的人类胚胎干细胞的全能性增长也表明。
Abstract
本视频演示了如何维持人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）在馈线无细胞的条件和如何在馈线不断通过人类胚胎干细胞的无细胞条件的增长。在馈线无细胞的条件下，免疫荧光显微镜确认的人类胚胎干细胞的全能性增长也表明。
Protocol
分割胚胎干细胞从基质胶基质胶
通常一个融合的6孔盘基质胶上的人类胚胎干细胞可以分裂1:3到1:5到另一个基质胶盘，井成为融合再次分裂后的4-5天。
- CM和基质胶板准备上述分裂之前。
- 当天分裂，分裂洗每口井用1 × PBS，PH7.4，加1mg/ml的Dispase（稀释原液的DMEM/F12媒体5mg/ml）1ml到每口井，并在37 ° C 3分钟。
- 每口井三次洗1 × PBS，PH7.4，无碱性成纤维细胞生长因子添加的ES媒体1毫升，使用细胞刮刀刮去井底部的殖民地，收集在一个50毫升猎鹰管悬浮人类胚胎干细胞，并通过离心沉淀在200克在室温下5分钟。
- 重制版的人类胚胎干细胞在基质胶板，首先用DMEM/F12培养基质胶板并添加在10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子每口井为辅的CM2.5毫升。的人类胚胎干细胞沉淀重悬在适当的CM与吸管的细胞悬液，在10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，上下三次补充量。 （注：当分裂的胚胎干细胞从基质胶板，团块是很容易打破，因此三轮的吹打足够多吹打可能过度破坏的殖民地，使单细胞）分装人类胚胎干细胞团块悬浮每0.5毫升6以及基质胶板，每孔终体积达到3毫升。放置在37℃孵化器板。
多潜能性标志物免疫荧光显微镜检测
免疫荧光显微镜是用来检查过程中培养的人类胚胎干细胞多能性标志物Oct - 4和SSEA - 4的表达。
- 从一个以及媒体和吸用1 × PBS，pH值7.4。添加3.7％的甲醛2毫升以及固定为10分钟。
- 冲洗1xPBS，pH值7.4，添加2毫升甲醇以及和地方在-20 ° C，2分钟。
- 1xPBS，pH值7.4，并阻止1毫升0.2％的牛serume白蛋白（BSA），5分钟冲洗。
- 添加液1ml，10月4或anti-h/mSSEA-4抗体（1:200稀释在0.2％BSA），室温孵育1小时或4℃过夜。 （注：SSEA - 4染色，直接进入第6步）
- 1xPBS，pH值7.4冲洗3次，加FITC标记的兔IgG（1:500稀释在0.2％BSA），并在室温下孵育1小时。
- 1xPBS，pH值7.4冲洗3次，并把在井的中心安装解决方案的下降（可以包含的DAPI核可视化所需）。放在盖玻片上的细胞上，用指甲油密封，免疫荧光显微镜和评估。
人类胚胎干细胞的收益
ES媒体（胚胎干细胞介质）：
DMEM/F12 - 400毫升
淘汰赛血清替代品 - 100毫升
非必需氨基酸 - 5毫升
200MM GlutaMax / BME解决方案 - 5毫升
青霉素/链霉素 - 5毫升
拌匀，并储存于4 500ml中瓶最后的人类胚胎干细胞文化传媒° C。最多两个星期。
MEF的文化传媒：
DMEM - 1000毫升
胎牛血清 - 100毫升
非必需氨基酸 - 10毫升
谷氨酰胺 - 10毫升
Penicllin /链霉素 - 10毫升
拌匀，存放在4决赛MEF的文化传媒° C。
200MM Glutamax / BME解决方案：
Glutamax - 100毫升
β-巯基乙醇（股份14.3M解决方案） - 140μ1
混合了两个解决方案，然后分装10毫升部分。保持在-20 ° C等分
方案碱性成纤维细胞生长因子（终浓度的股票：10微克/ ml）：
碱性成纤维细胞生长因子（FGF2） - 50微克
1xPBS BSA的0.1％，pH值7.4 - 5毫升
溶解于5ml 0.1％BSA碱性成纤维细胞生长因子50微克至10微克/毫升股票。分装成500μL部分。储存在-80 ° C。
胶原酶溶液（1mg/ml的）：
胶原酶 - 50毫克
DMEM/F12媒体 - 50毫升
胶原酶粉添加至50ml猎鹰管。在油烟机，混合在无菌的DMEM/F12媒体50毫升。涡<1分钟的解决方案。确保被溶解的粉末。在油烟机，通过0.22微米到一个新的无菌50毫升猎鹰管的过滤器。这个解决方案是为2周最大保存在4 ° C。
Dispase溶液（1mg/ml的）：
Dispase 5mg/ml - 2毫升
DMEM/F12媒体 - 8毫升
分装商业5mg/ml Dispase解决方案，并储存在-20 ° C。稀释dispase 1mg/ml的使用的DMEM/F12。该解决方案可以保持1周，在4 ° C。
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Discussion
这一系列3视频演示如何成长人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）对小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层细胞（视频1），如何通过他们基质胶馈线无细胞板（视频2），以及如何维护人类胚胎干细胞在基质胶馈线无细胞（视频3）的条件下传代。许多以前的研究表明，可行的，未分化的胚胎干细胞的维护需要灭活MEF饲养层细胞培养。然而，许多实验，纯免费接驳细胞污染的人类胚胎干细胞的人口是必需的。为了实现这一目标，我们已经演示了如何通过人类胚胎干细胞MEF馈线板，馈线细胞无基质胶板，以及如何保持和不断流逝的人类胚胎干细胞的殖民地细胞在馈线，自由的条件。以下协议，少量的MEF馈线细胞污染可以通过在基质胶板块之一仍然存在，但这种污染物通常是容易的可视化。基质胶通过两个和超越，没有MEF的污染通常是发现，离开纯粹的人类胚胎干细胞用于实验人口。人类胚胎干细胞全能性的标志物，如Oct - 4和SSEA - 4，免疫荧光染色和显微镜或流式细胞仪是需要确认的人类胚胎干细胞在一个文化过程中的未分化状态的维护。
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Acknowledgments
在Teitell实验室的人类胚胎干细胞研究是由加州再生医学研究所（CIRM）种子批RS1 - 00313的支持。我们感谢的再生医学和干细胞研究的加州大学洛杉矶分校，特别是博士Amander克拉克，博士杰罗姆扎克，和加州大学洛杉矶分校的Broad研究所干细胞核心设施为支持我们的研究成员的广泛中心的成员。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
