Summary
SDD-AGE è una tecnica utile per la rilevazione e la caratterizzazione di amiloide-come i polimeri nelle cellule. Qui mostriamo un adattamento che rende questa tecnica suscettibile di applicazioni su larga scala.
Abstract
Aggregazione amiloide è associata a numerose patologie misfolding ed è alla base delle proprietà dei prioni infettivi, che sono conformationally auto-template proteine che si pensa siano ruoli benefico negli organismi inferiori. Amiloidi sono notoriamente difficili da studiare a causa della loro insolubilità ed eterogeneità strutturale. Tuttavia, la risoluzione di polimeri amiloide in base alle dimensioni e insolubilità detergente è stato reso possibile da semi-denaturazione detergente-Agarosio elettroforesi su gel (SDD-AGE). Questa tecnica sta trovando ampio utilizzo per la rilevazione e la caratterizzazione di varianti amiloide conformazionale. Qui, dimostriamo un adattamento di questa tecnica che facilita il suo utilizzo in applicazioni su larga scala, come schermi per i prioni romanzo e altre proteine amiloidogenica. Il nuovo SDD-AGE metodo utilizza trasferimento capillare per una maggiore affidabilità e facilità di utilizzo, e consente a qualsiasi gel dimensionato per essere ospitati. Così, un gran numero di campioni, preparati da cellule o proteine purificate, possono essere trattati simultaneamente per la presenza di SDS-insolubile conformeri di proteine marcate.
Protocol
Parte 1: Preparazione del gel
- Montare il vassoio di colata gel. Di serie per elettroforesi DNA orizzontali possono essere utilizzati. Per un gran numero di campioni, ci prepariamo a 20 cm x 24 cm lastra con fino a quattro 50-pettini bene. Assicurarsi che la lastra non ha graffi, come questi possono distorcere l'immagine macchia.
- Creare una soluzione di agarosio 1,5% (media o alta forza di gel, a basso EEO) in TAE 1X. Il volume dovrebbe essere sufficiente per sommergere completamente i denti pettine - si desidera caricare campione il più possibile per massimizzare il rilevamento. Microonde l'impasto fino a quando il agarosio è completamente sciolto.
- Si possono aggiungere rapidamente SDS allo 0,1% da uno stock del 10%. Mescolare. Se alcuni di agarosio si solidifica in questa fase, scioglierla con un piatto caldo e stare attenti per evitare di ebollizione.
- Versare la soluzione nel cassetto casting. Usare un pettine a rastrello eliminare le bolle, come si potrebbe poi interferire con il trasferimento.
- Dopo gel ha stabilito, pettini rimuovere e posizionare il gel nel serbatoio gel. Immergere completamente il gel in TAE 1X contenente 0,1% SDS.
Parte 2: Preparazione dei campioni
- Per high-throughput analisi dei lisati di lievito, si comincia con 2 ml culture cresciute durante la notte con l'agitazione rapida da 96 pozzetti blocchi. In questo caso, ogni cultura è sovraesprimono una proteina di interesse. Quando si analizzano le proteine poco abbondanti, grandi volumi di coltura deve essere utilizzato
- Celle di raccolta per centrifugazione a 2000 RCF per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Risospendere le cellule in acqua e centrifugare di nuovo.
- Risospendere in 1 ml di soluzione spheroplasting. Incubare per circa 30 minuti a 30 ° C (si può confermare l'efficienza spheroplasting al microscopio).
- Centrifugare a 800 RCF per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere completamente il surnatante.
- Risospendere sferoplasti pellet in 100 ml di tampone di lisi.
- Coprire il blocco con nastro e vortice ad alta velocità per 2 minuti.
- Pellet residui cellulari a 4000 RCF per 2 minuti.
- Rimuovere con cura il supernatante in un nuovo contenitore, ad esempio, una piastra a 96 pozzetti PCR.
- Se lo si desidera, determinare la concentrazione di proteine del lisati.
- Aggiungi tampone 4X campione per i campioni di generare lisati contenente 1X tampone del campione. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Carico gel. Se lo si desidera, salvare la metà del volume del campione e bollire per SDS-PAGE analisi. Al fine di monitorare l'entità del trasferimento in seguito, dotati di un pre-colorato SDS-PAGE marcatore. Inoltre, un marcatore di peso molecolare costituita da proteine molto grandi (ad esempio, pollo pettorale estratto) può essere utilizzato per stimare le dimensioni dei complessi risolto.
- Funzionare a bassa tensione (≤ 3 V / cm lunghezza gel) fino a quando il fronte del colorante raggiunge ~ 1 cm dalla fine del gel. Questo richiederà parecchie ore. E 'importante che il gel rimangono fredde, altrimenti la diffusione di proteine a basso peso molecolare (ad esempio, monomeri) possono limitare la loro rilevazione.
Parte 3: Trasferimento
- Tagliare un pezzo di nitrocellulosa per le stesse dimensioni del gel.
- Taglio di 20 pezzi GB004 e GB002 8 pezzi di carta assorbente, per le stesse dimensioni del gel. Tagliare un pezzo aggiuntivo di GB004 per essere usato come uno stoppino, ne fanno circa 20 centimetri più largo del gel.
- Immergere la nitrocellulosa, stoppino, e 4 pezzi di GB002 in TBS 1X.
- In un contenitore di plastica, assemblare una pila di fogli come segue: 20 pezzi di secco GB004, poi 4 pezzi di GB002 secco, poi un pezzo di pre-umido GB002. Stendere la nitrocellulosa in cima a questo stack.
- Sciacquare il gel brevemente sulla barra di colata in acqua per rimuovere l'eccesso tampone di corsa. Poi, con attenzione cominciano a far scorrere il gel fuori dal cassetto nello stack. Facendo scorrere il gel fuori dal cassetto, bagnare la membrana con TBS, se necessario. Il buffer in più aiuta a prevenire le bolle di diventare intrappolato sotto il gel. Una pipetta di trasferimento funziona bene per questo scopo.
- Dopo che il gel è stata spostata la pila, controllare accuratamente per bolle. Se presenti, sollevare il bordo del gel e riapplicare buffer finché le bolle possono essere risolte.
- Mettere i restanti tre pre-bagnate GB002 pezzi sulla parte superiore del gel. Garantire un perfetto contatto tra tutti i livelli facendo rotolare una pipetta saldamente nella parte superiore dello stack.
- Fiancheggiano la pila di trasferimento con due vaschette contenenti TBS. Far passare il pre-stoppino bagnato tutto lo stack in modo tale che entrambe le estremità dello stoppino è immerso in TBS.
- Coprire la pila trasferimento assemblato con un vassoio di plastica ulteriore cuscinetto di peso in più (per esempio, un flacone da 500 ml di acqua).
- Consentire il trasferimento di procedere per un minimo di tre ore, o durante la notte.
- Dopo il trasferimento, la membrana possono essere elaborati da standard di Western blotting.
Soluzione Spheroplasting
1,2 M D-sorbitolo
0,5 mM MgCl 2
20 mM Tris, pH 7,5
50 mM BME (aggiungere fresco)
0,5 mg / ml Zymolyase 100T (aggiungere fresco)
coration: underline; "> Lysis Buffer
100 mM Tris 7,5
50 mM NaCl
10 mM BME (aggiungere fresco)
inibitori della proteasi (aggiungere fresco)
Sample Buffer 4X
2X TAE
20% di glicerolo
8% SDS
blu di bromofenolo alle preferenze
Discussion
SDD-AGE è stato riportato da Kryndushkin et al. 1, per studiare SDS-resistenti complessi del [PSI +] prioni nel lievito, e da allora ha trovato ampio utilizzo studiando sia prioni e non prione aggregati 2-9. Tuttavia, il trasferimento delle proteine ad una elettroforesi membrana a seguito di un gel di agarosio è problematico, e può portare a una immagine distorta macchia 5. Inoltre, la tecnica sommersa elettroblotting più comunemente usato introduce limitazioni pratiche per le dimensioni del gel e quindi il numero di campioni che possono essere elaborati. Abbiamo affrontato questi problemi con l'impiego verso il basso il trasferimento capillare 10, una procedura semplice che utilizza una pila di carta assorbente per asciugare il trasferimento delle proteine dal gel ad una membrana di nitrocellulosa. Trasferimento capillare impedisce la distorsione e permette gel grande per essere elaborati facilmente. Ci sono alcune cose da considerare prima di utilizzare SDD-AGE. Per i campioni grezzi (ad esempio, lisati), immunolocalizzazione di proteine specifiche è necessaria. SDD-AGE non è pienamente denaturare i complessi proteina di interesse, per cui la proteina (s) per essere rilevato deve recare un tag epitopo al di fuori della regione amiloidogenica. Lisati può generalmente essere preparati come lo sarebbero per un normale SDS-PAGE, con due importanti differenze. In primo luogo, una maggiore attenzione deve essere adottate per impedirne la degradazione per proteolisi. Le condizioni di parziale denaturazione usati qui non sono sufficienti a inattivare le proteasi, e possono anche rendere proteine bersaglio più suscettibile alla proteolisi. Utilizzare un completo cocktail inibitore della proteasi in almeno due volte la concentrazione raccomandata. In secondo luogo, il riscaldamento i campioni devono essere evitati. Se un all-monomero controllo negativo è desiderato, per esempio per confermare che alto peso molecolare specie non sono dovuti a modificazioni covalenti, a 10 minuti di incubazione a 95 ° C può essere utilizzato, che consentirà di ripristinare la maggior parte alle proteine amiloidi monomerico.
Acknowledgments
Ringraziamo Simone Alberti per l'assistenza nello sviluppo di questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Institutes of Health (GM25874), un Howard Hughes Medical Institute Investigatorship (per SL), e un National Science Foundation predoctoral borsa di formazione (a RH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zymolyase 100T | Seikagaku Corporation | 120493-1 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78429 | |
| Hybond-C extra nitrocellulose | Amersham | RPN303E | |
| GB004 blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 10427926 | |
| GB002 (3MM Chr) blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-917 | |
| Agarose (UltraPure) | Invitrogen | 15510-027 |
References
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