Summary
SDD-AGE är en användbar teknik för upptäckt och karakterisering av amyloid-liknande polymerer i celler. Här visar vi en anpassning som gör att denna teknik lämpar sig för storskaliga tillämpningar.
Abstract
Amyloid aggregering är förknippad med många sjukdomar proteiners ansamling och ligger bakom infektiösa egenskaper prioner, som är conformationally själv-mallhantering proteiner som tros ha positiva roller hos lägre organismer. Amyloid har notoriskt svårt att studera på grund av sin olöslighet och strukturella heterogenitet. Dock har upplösning av amyloid polymerer baserade på storlek och diskmedel olöslighet gjorts möjligt genom Semi-Denaturering Tvättmedel-agarosgelelektrofores (SDD-AGE). Denna teknik är att hitta utbredd användning för upptäckt och karakterisering av amyloid konformationsanalys varianter. Här visar vi en anpassning av denna teknik som underlättar dess användning i storskaliga tillämpningar, såsom skärmar för nya prioner och andra amyloidogenic proteiner. Det nya SDD-AGE-metoden använder kapillär överföring för större tillförlitlighet och användarvänlighet, och låter alla storlekar gelen skall förvaras. Således kan ett stort antal prover, som framställts av celler eller renade proteiner, behandlas samtidigt för förekomst av SDS-olösliga conformers av taggade proteiner.
Protocol
Del 1: Förbereda gelen
- Montera brickan gelen gjutning. Standardutrustning för horisontell DNA elektrofores kan användas. För ett stort antal prover, förbereder vi en 20 cm x 24 cm platta med upp till fyra 50-bra kammar. Se till att plattan inte har repor, eftersom dessa kan förvränga blot bilden.
- Skapa en 1,5% agaroslösningen (medium eller hög gel-styrka, låg EMO) i 1X TAE. Volymen ska vara tillräcklig för att fullständigt dränka kammen tänder - du kommer att vilja läsa så mycket prov som möjligt för att maximera upptäckt. Mikrovågsugn blandningen tills agarosen är helt upplöst.
- Snabbt lägga SDS till 0,1% från 10% lager. Swirl att blanda. Om några agarosen stelnar under detta steg, löses med hjälp av en värmeplatta och vara noga med att undvika kokning.
- Häll över lösningen i gjutningen facket. Använd en kam för att kratta ut några bubblor, de kunde senare störa överföringen.
- När gelen har satt, ta bort kammar och placera gelen i gelen tanken. Helt Sänk ner gelen i 1X TAE innehållande 0,1% SDS.
Del 2: Förbereda prover
- För high-throughput analys av jäst lysates, börjar vi med 2-ml kulturer vuxit över natten med snabb omrörning i 96-bra block. I detta fall är varje kultur överuttryck av ett protein av intresse. Vid analys liten förekomst proteiner, måste större kulturvolymer användas
- Harvest cellerna genom centrifugering vid 2000 RCF i 5 min vid rumstemperatur.
- Resuspendera cellerna i vatten och centrifugera igen.
- Resuspendera i 1 ml spheroplasting lösning. Inkubera i ca 30 minuter vid 30 ° C (du kan bekräfta spheroplasting effektiviteten med mikroskopi).
- Centrifugera vid 800 RCF i 5 min vid rumstemperatur. Helt ta bort supernatanten.
- Resuspendera pelleterat spheroplasts i 100 ml lyseringsbuffert.
- Täck blocket med tejp och skaka på hög hastighet i 2 min.
- Pellets cellulärt skräp vid 4000 RCF i 2 min.
- Ta försiktigt bort supernatanten till en ny container, t.ex. ett 96-bra PCR-plattan.
- Om du vill kan bestämma proteinets koncentration av lysates.
- Lägg 4X prov buffert för att de prover för att generera lysates innehåller 1X prov buffert. Inkubera 5 minuter vid rumstemperatur.
- Ladda gel. Om så önskas, spara hälften av provvolymen och koka den för SDS-PAGE analys. För att övervaka i vilken utsträckning överföring senare, inkluderar en pre-färgade SDS-PAGE markör. Dessutom kan en molekylviktsmarkör bestående av mycket stora proteiner (t.ex. kyckling pectoralis extrakt) användas för att uppskatta storleken på löst komplex.
- Kör på låg spänning (≤ 3 V / cm gel längd) tills färgen når ~ 1 cm från änden av gelen. Detta kommer att ta flera timmar. Det är viktigt att gelen förblir svala, annars diffusion av lågmolekylära proteiner (t.ex. monomerer) kan begränsa deras upptäckt.
Del 3: Överför
- Klipp en bit av nitrocellulosa i samma dimensioner som gelen.
- Klipp 20 bitar av GB004 och 8 bitar GB002 läskpapper till samma dimensioner som gelen. Klipp en extra bit GB004 att användas som en veke, gör det cirka 20 centimeter bredare än gelen.
- Sänk ned nitrocellulosa, veken, och 4 bitar av GB002 i 1X TBS.
- I en plastbehållare, montera en bunt papper som följer: 20 bitar av torra GB004, då 4 bitar av torra GB002, sedan en bit före våta GB002. Lägg nitrocellulosa på toppen av denna stack.
- Skölj gelen på gjutning plattan en kort stund i vatten för att avlägsna överflödig löpande buffert. Sedan försiktigt börja glida gelen ur facket på stacken. Samtidigt glider gelen ur facket, släck membranet med TBS vid behov. Den extra bufferten förhindrar bubblor från att bli instängda i gelen. En överföringspipett fungerar bra för detta ändamål.
- När gelen har flyttats till stacken, kolla noga för bubblor. Om något finns, lyft kanten av gelen och återanvända buffert så att bubblorna kan utarbetas.
- Sätt de återstående tre före fuktade GB002 bitar ovanpå gelen. Säkerställa fullständig kontakt mellan alla lager genom att rulla en pipett fast överst i bunten.
- Flank överföringen stacken med två förhöjda lådor med TBS. Drapera före våta veke hela bunten så att vardera änden av veken är nedsänkt i TBS.
- Täck de församlade överföringen stacken med ytterligare en plastbricka med extra vikt (t ex en 500 ml flaska vatten).
- Låt överföringen fortsätta i minst tre timmar eller över natten.
- Efter överföring kan membranet bearbetas av standard Western blotting.
Spheroplasting Lösning
1,2 M D-sorbitol
0,5 mM MgCl 2
20 mM Tris, pH 7,5
50 mM BME (lägg färska)
0,5 mg / ml Zymolyase 100T (lägg färska)
coration: underline; "> lyseringsbuffert
100 mM Tris 7,5
50 mM NaCl
10 mM BME (lägg färska)
proteashämmare (lägg färska)
4X Exempel Buffer
2X TAE
20% glycerol
8% SDS
Bromfenolblått till önskemål
Discussion
SDD-AGE först rapporterades av Kryndushkin et al. 1, för att studera SDS-resistenta komplex av [PSI +] prion i jäst, och har sedan funnit en bred användning studera både prioner och andra prion aggregat 2-9. Det är dock överföring av proteiner till ett membran efter elektrofores på en agarosgel problematiska, och kan resultera i en förvrängd blot bild 5. Dessutom introducerar nedsänkt electroblotting teknik som används mest praktiska begränsningar för storleken på gelen och därmed antalet prover som kan behandlas. Vi har tagit upp dessa problem genom att anställa nedåt kapillär överföra 10, en enkel procedur som använder en bunt torrt gråpapper att överföra proteiner från gelen till ett nitrocellulosa membran. Kapillär överföra förhindrar distorsion och tillåter stora geler som ska behandlas enkelt. Det finns några saker att tänka på innan du använder SDD-AGE. För rå prover (t.ex. lysates) är immunodetection av specifika proteiner som behövs. SDD-AGE inte fullt denaturera proteinkomplex av intresse, så det protein (er) som skall detekteras måste bära en epitop tagg utanför amyloidogenic regionen. Lysates kan generellt förberedda som de skulle vara för en normal SDS-PAGE, med två viktiga skillnader. Först måste en ökad försiktighet iakttas för att förhindra nedbrytning av proteolys. Den delvis denaturering villkor används här inte är tillräckliga för att inaktivera proteaser, och kan också göra målproteiner mer mottagliga för proteolys. Använd en komplett cocktail proteashämmare vid minst två gånger den rekommenderade koncentrationen. För det andra, uppvärmning av prover bör undvikas. Om en all-monomer negativ kontroll önskas, t.ex. för att bekräfta att med hög molekylvikt arter är inte på grund av kovalenta modifieringar, en 10-minuters inkubation vid 95 ° C kan användas, vilket kommer att återställa de flesta amyloid till monomera protein.
Acknowledgments
Vi tackar Simon Alberti för hjälp med att utveckla detta protokoll. Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health (GM25874), en Howard Hughes Medical Institute Investigatorship (SL), och en National Science Foundation predoctoral utbildning bidrag (till RH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zymolyase 100T | Seikagaku Corporation | 120493-1 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78429 | |
| Hybond-C extra nitrocellulose | Amersham | RPN303E | |
| GB004 blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 10427926 | |
| GB002 (3MM Chr) blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-917 | |
| Agarose (UltraPure) | Invitrogen | 15510-027 |
References
- Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).
- Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION. J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).
- Allen, K. D., et al. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+]. Genetics. 169, 1227-1242 (2005).
- Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation. The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).
- Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase. Current Genetics. 49, 21-29 (2006).
- Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids. J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).
- Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability. Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).
- Douglas, P. M., et al. Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).
- Nagy, B., Costello, R., Csako, G. Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping. Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).
