Summary
SDD-AGE é uma técnica útil para a detecção e caracterização de amilóide como polímeros nas células. Aqui nós demonstramos uma adaptação que torna esta técnica passível de aplicações em larga escala.
Abstract
Agregação amilóide está associada com patologias diversas proteínas misfolding e subjaz as propriedades de príons infecciosos, que são auto-conformationally templating proteínas que são pensados para ter papéis benéficos em organismos inferiores. Amilóides foram extremamente difíceis de estudar devido à sua insolubilidade e heterogeneidade estrutural. No entanto, a resolução de polímeros amilóide com base no tamanho e insolubilidade detergente tem sido possível graças ao Semi-desnaturação Detergente-Eletroforese em Gel de Agarose (SDD AGE). Esta técnica é encontrar amplo uso para a detecção e caracterização de variantes amilóide conformacional. Aqui, nós demonstramos uma adaptação dessa técnica que facilita seu uso em aplicações em larga escala, tais como telas para prions romance e outras proteínas amiloidogênicas. O método SDD-AGE novos usos de transferência capilar para maior confiabilidade e facilidade de uso, e permite que qualquer gel dimensionados para ser acomodados. Assim, um grande número de amostras, preparadas a partir de células ou proteínas purificadas, podem ser processadas simultaneamente para a presença de SDS-conformistas de proteínas insolúveis marcados.
Protocol
Parte 1: Preparação do gel
- Montar a bandeja de fundição gel. Equipamento padrão para eletroforese de DNA horizontal pode ser usada. Para um grande número de amostras, nós preparamos a 20 cm x 24 cm da laje com até quatro de 50 pentes bem. Certifique-se que a laje não tem arranhões, pois estas podem distorcer a imagem blot.
- Criar uma solução de agarose 1,5% (média ou alta força de gel, EEO baixo) em 1X TAE. O volume deve ser suficiente para submergir completamente os dentes do pente - você vai querer carregar amostra, tanto quanto possível para maximizar a detecção. Microondas a mistura até que a agarose é completamente dissolvido.
- Rapidamente adicionar SDS a 0,1% a partir de um estoque de 10%. Agite para misturar. Se alguns agarose solidifica durante esta etapa, dissolver novamente usando uma placa quente e ter cuidado para evitar a ferver.
- Despeje a solução no tabuleiro casting. Use um pente para ajuntar qualquer bolhas, pois mais tarde poderão interferir com a transferência.
- Depois de gel tem, retire os pentes e colocar o gel para o tanque de gel. Submergir completamente o gel em 1X TAE contendo 0,1% SDS.
Parte 2: Preparando-se amostras
- Para high-throughput análise de lisados de levedura, começamos com 2 ml-culturas cultivadas durante a noite com agitação rápida em 96 poços blocos. Neste caso, cada cultura é superexpressão de uma proteína de interesse. Ao analisar proteínas baixa abundância, maiores volumes de cultura deve ser utilizado
- Células colheita por centrifugação a 2000 RCF por 5 min à temperatura ambiente.
- Ressuspender as células em água e centrifugar novamente.
- Ressuspender em 1 ml de solução spheroplasting. Incubar por aproximadamente 30 min a 30 ° C (você pode confirmar a eficiência spheroplasting por microscopia).
- Centrifugar a 800 rcf durante 5 min à temperatura ambiente. Remover completamente o sobrenadante.
- Ressuspender esferoplastos peletizadas em 100 ml tampão de lise.
- Cubra o bloco com fita e vortex em alta velocidade por 2 min.
- Pellet restos celulares em 4000 RCF por 2 min.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante para um novo recipiente, por exemplo, uma placa de 96 poços PCR.
- Se desejar, determinar a concentração de proteína do lisados.
- Adicionar tampão de amostra 4X às amostras para gerar lisados contendo 1X tampão de amostra. Incubar por 5 min à temperatura ambiente.
- Carga gel. Se desejar, salvar metade do volume de amostra e ferva por SDS-PAGE análise. A fim de monitorar a taxa de transferência mais tarde, incluem um pré-manchada marcador SDS-PAGE. Além disso, um marcador de peso molecular composta por proteínas muito grandes (por exemplo, frango peitoral extrato) pode ser usado para estimar os tamanhos dos complexos resolvido.
- Executado em baixa tensão (≤ 3 comprimento do gel V / cm) até a frente de corante atinge ~ 1 cm do final do gel. Isso vai demorar várias horas. É importante que o gel de manter a calma, caso contrário, a difusão de proteínas de baixo peso molecular (por exemplo, monômeros) pode limitar a sua detecção.
Parte 3: Transferência
- Corte um pedaço de nitrocelulose para as mesmas dimensões do gel.
- Corte de 20 peças de GB004 e GB002 8 pedaços de papel absorvente, para as mesmas dimensões do gel. Corte uma peça adicional de GB004 para ser usado como um pavio; torná-lo cerca de 20 centímetros mais largo que o gel.
- Mergulhe a nitrocelulose, pavio, e 4 pedaços de GB002 em 1X TBS.
- Em um recipiente de plástico, montar uma pilha de papéis da seguinte forma: 20 peças de GB004 seca, em seguida, 4 pedaços de GB002 seca, em seguida, um pedaço de pré-molhada GB002. Lay a nitrocelulose no topo desta pilha.
- Lavar o gel na bandeja de fundição brevemente em água para remover excesso de tampão de corrida. Então, com cuidado começar a deslizar o gel da bandeja na pilha. Enquanto desliza o gel da bandeja, extinguir a membrana com TBS, se necessário. O buffer extra ajuda a evitar bolhas de ficar preso sob o gel. A pipeta de transferência funciona bem para esta finalidade.
- Depois que o gel foi movido à pilha, analisar cuidadosamente as bolhas. Caso existam, levante a borda do gel e reaplicar tampão até que as bolhas podem ser trabalhados.
- Coloque os restantes três pré-molhada GB002 peças em cima do gel. Garantir o contato completo entre todas as camadas rolando uma pipeta firmemente na parte superior da pilha.
- Flanco a pilha de transferência com duas bandejas contendo elevados TBS. Drape o pavio pré-molhada em toda a pilha de tal forma que uma das extremidades do pavio está submerso em TBS.
- Cobrir a pilha de transferência montado com uma bandeja de plástico adicionais rolamento de peso extra (por exemplo, uma garrafa de 500 ml de água).
- Permitir a transferência para prosseguir para um mínimo de três horas, ou durante a noite.
- Após a transferência, a membrana pode ser processado por padrão Western blotting.
Solução Spheroplasting
1,2 M D-sorbitol
0,5 mM MgCl 2
20 mM Tris, pH 7.5
BME 50 mM (adicionar fresco)
0,5 mg / ml Zymolyase 100T (adicionar fresco)
coration: underline; "Tampão de Lise>
100 mM Tris 7,5
50 mM NaCl
10 mM BME (adicionar fresco)
inibidores da protease (adicionar fresco)
Tampão de amostra 4X
2X TAE
Glicerol 20%
8% SDS
azul de bromofenol a preferência
Discussion
SDD-AGE foi primeiramente relatada por Kryndushkin et al. 1, para estudar SDS-resistentes complexos do [PSI +] prion em levedura, e desde então tem encontrado uso generalizado estudar tanto prion e príon não-agregados 2-9. No entanto, a transferência das proteínas para uma membrana de eletroforese seguinte em um gel de agarose é problemático, e pode resultar em uma imagem distorcida blot 5. Além disso, a técnica submersa eletrobloting mais comumente utilizado apresenta limitações práticas para o tamanho do gel e, assim, o número de amostras que podem ser processados. Temos abordado estes problemas através do emprego de transferência capilar para baixo 10, um procedimento simples, que utiliza uma pilha de papéis secos blotting para transferir proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose. Transferência capilar evita a distorção e permite géis grande para ser processado facilmente. Há algumas coisas a considerar antes de usar SDD AGE. Para amostras de crude (por exemplo, lisados), imunodetecção de proteínas específicas é necessária. SDD-AGE não totalmente desnaturar a complexos de proteínas de interesse, de modo a proteína (s) a ser detectado deve ostentar uma etiqueta de epítopo fora da região amiloidogênicas. Lisados geralmente podem ser preparados como se fossem para um normal SDS-PAGE, com duas diferenças importantes. Em primeiro lugar, o cuidado maior deve ser tomado para evitar a degradação por proteólise. As condições de desnaturação parcialmente usados aqui não são suficientes para inativar proteases, e também pode fazer proteínas-alvo mais suscetível à proteólise. Use um coquetel inibidor de protease total em pelo menos duas vezes a concentração recomendada. Segundo, o aquecimento das amostras deve ser evitado. Se um controle de monômero de todos os negativos é desejada, por exemplo, para confirmar que de alto peso molecular de espécies não são devido a modificações covalentes, a incubação de 10 minutos a 95 ° C pode ser usada, que vai restaurar a maioria dos amilóides à proteína monomérica.
Acknowledgments
Agradecemos a Simon Alberti para obter ajuda com o desenvolvimento deste protocolo. Este trabalho foi suportado por uma concessão do National Institutes of Health (GM25874), um Howard Hughes Medical Institute Investigatorship (para SL), e da National Science Foundation bolsa de formação predoctoral (para RH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zymolyase 100T | Seikagaku Corporation | 120493-1 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78429 | |
| Hybond-C extra nitrocellulose | Amersham | RPN303E | |
| GB004 blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 10427926 | |
| GB002 (3MM Chr) blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-917 | |
| Agarose (UltraPure) | Invitrogen | 15510-027 |
References
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