Summary
SDD - AGEは細胞内のポリマーのようなアミロイドの検出と特性評価のための有用なテクニックです。ここでは、大規模なアプリケーションにこのテクニックは、従順になるの適応を示しています。
Abstract
アミロイド凝集は、下等生物に有益な役割を持っていると考えられているコンホメーション、自己鋳型タンパク質である多数のタンパク質のミスフォールディングの病態と根底プリオンの感染特性、関連付けられています。アミロイドは、不溶性と構造の異質性のために勉強するのが困難でした。しかし、大きさと界面活性剤不溶性に基づくアミロイド重合体の分解能は、洗剤、アガロースゲル電気泳動（SDD - AGE）セミ変性によって可能とされています。この手法は、アミロイドコンフォメーションの変種の検出と特性評価のための広範な使用を見つけることです。ここで、我々はそのような新規のプリオンおよび他のアミロイド蛋白質のためのスクリーンのような大規模なアプリケーションでその使用を容易にこの技術の適応を示しています。新しいSDD - AGEの方法は、より高い信頼性と使いやすさのためにキャピラリートランスファーを使用して、任意のサイズのゲルを収容することができます。従って、細胞または精製タンパク質から調製したサンプルの多くは、タグ融合タンパク質のSDS不溶性配座の存在を同時に処理することができます。
Protocol
パート1：ゲルの準備
- ゲルキャスティングトレイを組み立てます。水平方向のDNAの電気泳動のための標準機器を使用することができます。大量のサンプルでは、最大4つの50ウェルコームを持つx 24センチメートルスラブ20cmの準備。これらは、ブロットの画像を歪ませることができるようにスラブが、傷を持っていないことを確認してください。
- 1X TAEの1.5％アガロース溶液（培地または高ゲル強度、低いEEO）を作成します。ボリュームは完全に水没するのに十分な櫛歯でなければなりません - あなたは、検出を最大化するために、できるだけ多くのサンプルを読み込むことになるでしょう。アガロースが完全に溶解するまで電子レンジで混合。
- 急速に10％の株式を0.1％にSDSを追加。ミックスに渦巻く。いくつかのアガロースがこのステップ中に固化する場合、ホットプレートを用いて再溶解し、沸騰を避けるために注意してください。
- キャスティングトレイにソリューションを注ぐ。彼らは後に転送を妨げる可能性があるので、あらゆる気泡アウト熊手に櫛を使用してください。
- ゲルが設定された後、櫛を削除し、ゲルのタンクにゲルを置く。完全に水没1X TAEのゲルは、0.1％SDSを含む。
第2部：準備のサンプル
- 酵母溶解物のハイスループット分析のために、我々は、96ウェルブロック単位で急速に撹拌しながら一晩生育2 mlの培養液から始まります。この場合、それぞれの文化が過剰発現は、目的のタンパク質です。低濃度のタンパク質を分析する際に、大きな文化のボリュームを使用する必要があります
- 室温で5分間2000 RCFで遠心分離により細胞を回収。
- 再び水と遠心で細胞を再懸濁します。
- 1ミリリットルspheroplasting溶液中に再懸濁します。 30 ° C（あなたが顕微鏡によりspheroplasting効率を確認すること）で約30分間インキュベートする。
- 室温で5分間、800 RCFで遠心する。完全に上清を取り除く。
- 100 mlの溶解バッファーでペレットスフェロプラストを再懸濁します。
- テープと2分間高速でボルテックスでブロックをカバー。
- 2分は4000 RCFでペレットを細胞破片。
- 慎重に新しい容器、例えば、96ウェルPCRプレートに上清を取り除く。
- 必要に応じて、溶解液のタンパク質濃度を決定する。
- 1Xサンプルバッファーを含む溶解液を生成するためにサンプルに4Xサンプルバッファーを添加します。室温で5分間インキュベートする。
- ゲルをロードします。必要に応じて、サンプルの量の半分を保存し、SDS - PAGE分析のためにそれを煮る。後で転送の程度を監視するために、事前に染色したSDS - PAGEのマーカーが含まれています。さらに、非常に大規模なタンパク質（例えば、ニワトリ胸筋エキス）から成る分子量マーカーを解決複合体の大きさを推定するために使用することができます。
- 色素フロントがゲルの端から約1センチメートルに達するまで、低電圧（≤3 V / cmのゲルの長さ）で動作します。これには数時間かかります。ゲルは涼しいままであることが重要です、それ以外の低分子量のタンパク質（例えば、単量体）の拡散は、それらの検出を制限することができます。
パート3：転送
- ゲルと同じ大きさにニトロセルロースの部分をカット。
- ゲルと同じ大きさにGB002吸い取り紙のGB004と8個、20個をカット。芯として使用されるGB004の追加部分をカットし、ゲルよりも約20cm広いそれを作る。
- ニトロセルロース、芯、および1X TBSでGB002の4個を浸し。
- ドライGB004の20個、その後乾いたGB002の4枚、その後プリウェットGB002の一枚：プラスチック容器では、次のように紙のスタックを組み立てる。ニトロセルロースは、このスタックの一番上に置く。
- 過剰な実行中のバッファを削除するには、水で簡単にキャスティングトレイ上でゲルをすすぐ。その後、慎重にスタックにプッシュトレイからゲルをスライドし始める。トレイからゲルをスライドさせながら、必要に応じてTBSで膜を消す。余分なバッファは、ゲルの下敷きになってから泡を防ぐのに役立ちます。転送ピペットは、この目的に適しています。
- ゲルがスタックに移動された後、泡が十分に確認してください。いずれかが存在する場合、ゲルの端を持ち上げ、気泡が正常に機能できるようになるまでバッファを再適用します。
- ゲルの上に残りの3つのプレ接液GB002ピースを置く。スタックの上部にしっかりとピペットを圧延して、すべてのレイヤーの間に徹底的な連絡を確保する。
- TBSを含む二つの高架トレイと脇腹転送スタックを。芯のどちらかの端がTBSに水没するようなスタック全体でプリウェット芯を羽織る。
- 余分な重量を（例えば、水の500mlボトル）を有する追加のプラスチック製のトレイでアセンブル転送スタックをカバーする。
- 転送は3時間の最小値、または一晩のために続行することができます。
- 転送後、メンブレンは標準ウェスタンブロット法で処理することができます。
Spheroplastingソリューション
1.2 M D -ソルビトール
0.5mMのMgCl 2の
20mMトリス、pH7.5の
50mMのBME（新鮮な追加）
は0.5 mg / mlのザイモリアーゼ100T（新鮮な追加）
coration：下線;">溶解バッファー
100mMのトリス7.5
50mMのNaCl
10mMのBME（新鮮な追加）
プロテアーゼ阻害剤（新鮮な追加）
4Xサンプルバッファー
2X TAE
20％のグリセロール
8％SDS
好みにブロモフェノールブルー
Discussion
SDD - AGEは、最初Kryndushkinらによって報告された。1のSDS耐性の複合体を研究するために[PSI +]酵母におけるプリオン、と以来、プリオンと非プリオン凝集体2から9の両方を研究する広範な使用を発見した。しかし、アガロースゲルの膜以下の電気泳動のタンパク質の転送には問題がある、と歪んだブロットの画像5で発生する可能性があります。また、最も一般的に使用される水中エレクトロブロッティングの手法は、このようにゲルの大きさと処理できるサンプル数のための実際的な制限が導入されています。我々は、下向きにキャピラリートランスファー10、ゲルからニトロセルロース膜にタンパク質を転送するためにドライブロッティング紙のスタックを使用する単純な手順を採用することにより、これらの問題に対処している。キャピラリートランスファーには、歪みを防止し、大きなゲルを容易に処理することが可能になります。 SDD - AGEを使用する前に、次の事項を考慮する必要があります。原油サンプル（例えば、溶解液）の場合は、特定のタンパク質の免疫検出が必要です。 SDD - AGEは完全に興味の蛋白質複合体を変性させないので、検出される蛋白質（s）はアミロイド地域の外にエピトープタグを負担しなければならない。彼らは通常のSDS - PAGEのためになるように溶解液は、一般的に2つの重要な違いで、調製することができる。最初に、タンパク質分解による劣化を防止するために増加に注意する必要があります。ここで使用される部分的に変性条件下では、プロテアーゼを不活性化するには不十分であり、また、タンパク質分解の標的蛋白質が影響を受けやすくすることができます。少なくとも2倍の推奨濃度で完全なプロテアーゼ阻害剤のカクテルを使用してください。第二に、サンプルを加熱することは避けるべきです。全単量体陰性コントロールが必要な場合には、例えば高分子量の種が単量体蛋白質に最もアミロイドを復元する共有結合修飾、95℃で10分間インキュベート° Cを使用することができる、によるものではないことを確認する。
Acknowledgments
我々は、このプロトコルの開発と援助のためにサイモンアルベルティに感謝。この作品は、国立衛生研究所（GM25874）、ハワードヒューズ医学研究所のInvestigatorship（SLまで）、および国立科学財団博士号を取得する前の訓練助成金（RHまで）からの助成金によって支えられて。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zymolyase 100T | Seikagaku Corporation | 120493-1 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78429 | |
| Hybond-C extra nitrocellulose | Amersham | RPN303E | |
| GB004 blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 10427926 | |
| GB002 (3MM Chr) blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-917 | |
| Agarose (UltraPure) | Invitrogen | 15510-027 |
References
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