Summary
SDD-YAŞ hücrelerde polimerler gibi amiloid algılama ve karakterizasyonu için yararlı bir tekniktir. Burada, bu tekniğin büyük ölçekli uygulamalarda mükellef kılar bir uyum göstermektedir.
Abstract
Amiloid agregasyonu conformationally olan pek çok protein misfolding patolojiler ve temelini prionlar bulaşıcı özellikleri, kendi kendine şablonu daha aşağı organizmalardan yararlı rolleri olduğu düşünülmektedir proteinler. Ile ilişkili. Amiloidleri çıkılmazlık ve yapısal heterojenite nedeniyle çalışma için herkesin bildiği gibi zor olmuştur. Ancak, boyutu ve deterjan çıkılmazlık dayalı amiloid polimerler çözünürlüğü mümkün hale olmuştur Yarı denatüre Deterjan Agaroz Jel Elektroforezi (SDD-AGE). Bu tekniğin yaygın kullanımı amiloid konformasyonel türevlerini tespit edilmesi ve karakterizasyonu için bir bulgudur. Burada, roman prionlar ve diğer amiloidojenik proteinler için ekranlar gibi büyük ölçekli uygulamaları, kullanımı kolaylaştıran bu tekniğin bir uyum göstermektedir. Daha fazla güvenilirlik için yeni SDD-AGE bir yöntem kılcal transferi kullanır ve kullanım kolaylığı, ve herhangi bir büyüklükteki jel yer sağlar. Böylece, hücre veya saflaştırılmış proteinlerin hazırladığı numuneler çok sayıda, etiketli proteinlerin SDS-çözünmez conformers varlığı için aynı anda işlenebilir.
Protocol
Bölüm 1: jel hazırlanması
- Jel döküm tepsi birleştirin. Standart donanım yatay DNA elektroforezi için kullanılabilir. Çok sayıda numune için, 20 cm kadar dört adet 50-iyi tarak x 24 cm döşeme hazırlar. Bu leke görüntüsünü bozabilir levha, çizik yoktur emin olun.
- 1X TAE% 1.5 agaroz çözeltisi (orta veya yüksek jel gücü, düşük EEO) oluşturun. Hacmi tamamen daldırın tarak dişleri için yeterli olmalıdır tespiti en üst düzeye çıkarmak için mümkün olduğunca çok örnek yüklemek isteyeceksiniz. Mikrodalga karışımı agaroz tamamen eriyene kadar.
- Hızla% 10 oranında hisse senedi% 0,1 SDS ekleyin. Çalkalanarak karıştırılır. Bu adım sırasında bazı agaroz katılaşır varsa, sıcak bir tabak kullanılarak çözülür ve kaynar önlemek için dikkatli olun.
- Çözüm döküm tepsiye dökün. Daha sonra transferi etkileyebilecek herhangi bir kabarcıkları dışarı komisyon bir tarak kullanın.
- Sonra jel seti, tarak kaldırmak jel ve jel tankının içine yerleştirin. Tamamen daldırın 1X TAE jel SDS% 0.1 içeren.
Bölüm 2: numunelerin hazırlanması
- Maya lizatları yüksek verimlilik analizi için, bir gecede 96-iyi blokların hızlı ajitasyon yetiştirilen 2 ml kültürleri ile başlar. Bu durumda, her kültürün ilgi eksprese bir protein. Düşük bolluk proteinleri analiz ederken, büyük kültür hacimleri kullanılması gerekir
- Hasat hücreler santrifüj yoluyla oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2000 RCF.
- Su ve santrifüj hücrelerin tekrar süspanse edin.
- 1 ml spheroplasting çözelti içinde süspanse edin. Yaklaşık 30 dakika boyunca inkübe 30 ° C (Mikroskop ile spheroplasting verimliliği onaylamak).
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 RCF santrifüjleyin. Tamamen süpernatant kaldırmak.
- 100 ml lizis tamponu pelet spheroplasts tekrar
- 2 dakika için yüksek hızlı bant ve vorteks blok örtün.
- 2 dakika süreyle 4000 RCF Pelet hücre kalıntıları vardır.
- Dikkatle yeni bir konteyner, örneğin, bir 96-PCR plate supernatant çıkarın.
- İsterseniz, lizatları protein konsantrasyonu belirler.
- 1X numune tamponu içeren lizatları üretmek için numuneler 4X numune tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- Jel Yük. İsterseniz, örnek hacmi yarısı kaydetmek ve SDS-PAGE analizi için kaynatın. Transfer ölçüde daha sonra izlemek için, bir ön-lekeli SDS-PAGE işaretleme içerir. Ayrıca, çok büyük proteinleri (örneğin, tavuk pektoralis özü) oluşan bir moleküler ağırlık belirteci çözülmesi kompleksleri boyutlarını tahmin etmek için kullanılabilir.
- Boya ön jel sonundan itibaren yaklaşık 1 cm ulaşır kadar alçak gerilim (≤ 3 V / cm jel uzunluğu) çalıştırın. Bu birkaç saat sürebilir. Jel serin kalması çok önemlidir, aksi halde düşük molekül ağırlıklı protein (örneğin, monomerler) difüzyon tespit sınırı.
Bölüm 3: Transfer
- Nitroselüloz, jel gibi aynı boyutta bir parça kesin.
- GB004 20 adet ve 8 adet GB002 blot kağıt, jel gibi aynı boyutta kesin. Kes bir fitil olarak kullanılmak üzere ek bir parça GB004 jel yaklaşık 20 santimetre daha geniş yapmak.
- 1X TBS nitroselüloz, fitil, 4 adet GB002, bırakın.
- 20 adet kuru GB004, daha sonra 4 adet kuru GB002, daha sonra tek parça ön ıslak GB002: Bir plastik kap, aşağıdaki gibi bir yığın kağıtları bir araya. Nitroselüloz bu yığının üstüne yatırın.
- Aşırı çalışan tampon kaldırmak için su döküm tepsi kısaca jel durulayın. Sonra, dikkatle jel yığının üzerine tepsi kapalı slayt başlar. Tepsiyi kapalı jel sürme, gerektiğinde TBS ile membran söndürmeye. Ekstra tampon jel altında sıkışmış olmanın kabarcıkları önlemeye yardımcı olur. Bu amaçla transfer pipet iyi çalışır.
- Jel yığınına taşındıktan sonra, kabarcıklar iyice kontrol edin. Herhangi biri mevcutsa, jel kenar kaldırın ve kabarcıkları dışarı çalıştı kadar tampon yeniden uygulayın.
- Jel üstünde kalan üç önceden ıslatılmış GB002 adet koyun. Yığının üst kısmında bir pipetle iyice haddeleme tüm katmanları arasındaki kapsamlı temas olun.
- TBS içeren iki yükseltilmiş tepsiler Kanat transfer yığını. Öncesi ıslak fitil fitil ya sonunda TBS batmış olduğunu yığını karşısında Örtüsü.
- Ekstra ağırlık taşıyan (örneğin, 500 ml şişe su) ek bir plastik tepsi ile bir araya transferi yığını örtün.
- En az üç saat veya gece boyunca devam transferine olanak sağlar.
- Aktarımdan sonra, membran standart Western blot tarafından işlenebilir.
Spheroplasting Çözüm
1,2 M D-sorbitol
0.5 mM MgCl 2
20 mM Tris, pH 7.5
50 mM BME (taze eklemek)
0.5 mg / ml Zymolyase 100T (taze eklemek)
coration: underline "> Lizis Tampon
100 mM Tris 7.5
50 mM NaCl
10 mM BME (taze eklemek)
proteaz inhibitörleri (taze eklemek)
4X Örnek Arabelleği
2X TAE
% 20 gliserol
% 8 SDS
tercihinize Bromophenol Mavi
Discussion
SDD-YAŞ ilk Kryndushkin ve arkadaşları tarafından rapor edilmiştir 1, SDS-dirençli kompleksleri çalışma [PSI +] maya prion, ve o zamandan beri hem prion ve prion olmayan agrega 2-9 okuyan yaygın kullanımı bulmuştur. Ancak, bir agaroz jel bir zar aşağıdaki elektroforez, proteinlerin transferi sorunlu ve çarpık bir leke görüntü 5 neden olabilir . Ayrıca, en sık kullanılan batık electroblotting tekniği jel boyutu için pratik sınırlamalar tanıtır ve böylece işlenebilir örneklerin sayısı. Biz aşağı kılcal transfer 10, jel nitroselüloz membran proteinleri aktarmak için bir yığın kuru blot kağıtları kullanan basit bir prosedür kullanılarak bu sorunları ele alınmıştır. Kılcal transfer bozulmasını engeller ve büyük jeller kolay işlenmesine olanak verir. SDD-YAŞ kullanarak önce dikkate alınması gereken bir kaç şey vardır. Ham örnekler için (örneğin, lizatları), spesifik proteinlerin İmmuno gerekli. SDD-AGE tamamen ilgi protein kompleksleri doğasını değildir, protein (lar) tespit edilmesi, amiloidojenik bölgenin dışında bir epitopu etiketi taşımalıdır. Lizatları genellikle normal bir SDS-PAGE olacağı gibi iki önemli farklılıklar hazırlanmış olabilir. İlk olarak, proteoliz tarafından bozulmasını önlemek için artan dikkat edilmelidir. Burada kullanılan kısmen denatüre koşulları proteazlar inaktive etmek için yeterli değildir ve de proteoliz hedef proteinler daha duyarlı yapabilirsiniz. En az iki kat önerilen konsantrasyonda tam bir proteaz inhibitörü kokteyl kullanın. İkincisi, numunelerin ısıtma kaçınılmalıdır. Bir all-monomer negatif kontrol isteniyorsa, örneğin yüksek molekül ağırlıklı türler monomerik protein en amiloidleri geri kovalent modifikasyonlar, 10 dakikalık bir inkübasyon 95 ° C kullanılabilir nedeniyle olmadığını onaylamak için.
Acknowledgments
Biz bu protokolü gelişmekte olan yardım için Simon Alberti teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (GM25874), Howard Hughes Tıp Enstitüsü Investigatorship (SL) ve Ulusal Bilim Vakfı predoctoral eğitim bursu (RH) bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zymolyase 100T | Seikagaku Corporation | 120493-1 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78429 | |
| Hybond-C extra nitrocellulose | Amersham | RPN303E | |
| GB004 blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 10427926 | |
| GB002 (3MM Chr) blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-917 | |
| Agarose (UltraPure) | Invitrogen | 15510-027 |
References
- Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).
- Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION. J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).
- Allen, K. D., et al. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+]. Genetics. 169, 1227-1242 (2005).
- Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation. The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).
- Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase. Current Genetics. 49, 21-29 (2006).
- Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids. J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).
- Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability. Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).
- Douglas, P. M., et al. Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).
- Nagy, B., Costello, R., Csako, G. Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping. Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).
