Summary

結核および多剤耐性結核の診断のためのMODSの方法

Published: August 11, 2008
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Summary

顕微鏡観測薬剤感受性(MODS)アッセイは、結核の高性能検出(TB)と多剤耐性結核(MDRTB)用の低コスト、ローテクのツールです。このビデオは、MODSの液体培地培養法を説明します。

Abstract

活動性肺結核の患者(TB)は、患者を硬化し、新たな感染症の予防の両方に不可欠な活動性結核を診断すること、毎年10月15日他の人に感染する。さらに、耐性結核(MDRTBを)多剤の出現は、その薬剤耐性の検出は、薬剤耐性菌の拡散を阻止するために必要であることを意味する。顕微鏡観測薬剤感受性(MODS)アッセイは、TBとMDRTBの高性能の検出のための低コスト、ローテクのツールです。結核菌(MTB)は、微細なMTBの成長は、固形培地上のコロニーの肉眼的外観を待っているよりも早期に液体培地で検出し、可能な)固形培地2に比べて液体培地でより速く成長する1):MODSのアッセイは、3つの原則に基づいていますその成長は、サブカルチャーは、実行をする必要がない、それは薬イソニアジドとリファンピシンがMDRTBの同時直接検出を可能にするためにMODSのアッセイに組み込むことができる非定型抗酸菌や真菌や細菌汚染3)と区別できるように、MTBの特徴です。間接的な薬剤感受性試験。競合する現在の診断は、喀痰塗抹標本と低感度、固体培地の文化、既存の液体培地培養法と法外に高いコスト、およびMDRTBを検出する間接的な薬剤感受性試験のためにサブカルチャーを行うために必要と診断されるまでに長い遅延によって妨げています。対照的に、非独占的なMODSの方法は、結核とMDRTBための高感度を有し、比較的迅速な培養法であり、MDRTBの同時薬剤感受性試験を提供し、リソースが限られた結核のためのテストのためのすぐ下に$ 3の設定にアクセス可能であり、 MDRTB。

Protocol

ストック溶液を準備する リン酸塩緩衝在庫一塩基性リン酸カリウム溶液(千ミリリットル蒸留水に溶解したリン酸カリウム一塩基の9.07グラム)の950ミリリットルでナトリウム塩基性溶液(千ミリリットルの蒸留水に溶解したナトリウム二塩基性リン酸の9.47グラム)の950ミリリットルを混合し、かき混ぜ、調整して戻ってそれぞれのソリューション50mlの維持pHは必要?…

Discussion

MODSのアッセイは、資源が限られた設定で対象としています。初めて、MODSは、結核の迅速な液体培養の検出のための能力をもたらし、テストあたりのすぐ下に$ 3で資源が限られた設定に耐性結核を多剤。 MODSは、非独占的、反復的な方法論であり、MODSのコミュニティは、常に他の研究室を作るために管理されていることの改善に興味を持っています。

液体がこぼれたり、エアロゾル化することができ?…

Acknowledgements

我々は、結核の成長タイムラプスビデオセグメントに対してショーンフィッツウォーターとカルメンGianninaルナコロンボに感謝します。我々は、現在のプロトコルは主に逐語的に取得されたユーザガイドを、編集中に彼女の徹底と優れたフィードバックのためマーティローパーを感謝し、共同編集。このビデオの制作は、NIH /フォガティ国際センターによって資金を供給されたhttp://www.fic.nih.gov/デビッドAJムーアが、ロンドン大学インペリアルカレッジで感染症の熱帯医学とリーダーのウェルカムトラスト臨床研究員(フェローとして貢献受賞番号078067/Z/05)。マークF. BradyはNIH /フォガティ国際センターの研究員として貢献した。

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Refrigerator/ freezer Equipment     to store pre-prepared broth and antibiotic stocks
Vortex Equipment     to aid sputum decontamination
Centrifuge Equipment     for sputum concentration; capable of reaching 3000 g; does not need to be refrigerated, but MUST be biosafe (buckets can be sealed)
Incubator (37 degree C) Equipment     for culture; need not be CO2 enriched
Inverted light microscope Microscope     to read MODS plates
Autoclave Equipment     to sterilize media, PBS and used plates
Balance Equipment     to weigh isoniazid, rifampicin and NALC
Middlebrook 7H9 broth (Difco) Reagent Fisher DF0713-17-9 500gr/bottle; culture media base
Casitone (pancreatic digest casein) Reagent Fisher DF0259‐17‐9 500gr/bottle; culture media base
Glycerol (glycerin) lyophilized Reagent Sigma G‐33‐500 500ml/bottle; culture media base
PANTA (Antibiotic mixture lyophilized BD) Reagent Fisher B4345114 6 bottles/pack; antibiotic media supplement
OADC (Middlebrook OADC enrichment BD) Reagent Fisher B11886 10 x 20ml/pack; nutritional media supplement
Dimethyl sulphoxide (Hibri-Max) Reagent Sigma D-2650 100ml/bottle; to prepare rifampicin stock
Antibiotic stocks: isoniazid Reagent Sigma I-3377 50gr/bottle; direct susceptibility testing
Antibiotic stocks: rifampicin Reagent Sigma 99 R-3501 1gr/bottle; direct susceptibility testing
Sodium hydroxide (pellets) Reagent Sigma 221465 500gr/bottle; sputum decontamination
Sodium citrate (trisodium salt dihydrate) Reagent Sigma S-4641 500gr/bottle; sputum decontamination
N-acetyl-L-cysteine Reagent Sigma A-7250 50gr/bottle; sputum decontamination
Potassium Phosphate Monobasic crystal. KH2PO4 Reagent Sigma P0662 500gr/bottle; sputum decontamination
Sodium Phosphate Dibasic, anhydrous. Na2HPO4 Reagent Sigma S0876 500gr/bottle; sputum decontamination
Sodium hypochlorite Reagent household bleach   to discard contaminated waste
15ml centrifuge tubes (polypropylene 15ml Falcon 35‐2096) Consumable Fisher 14‐959‐49B 500ea/case; for sputum decontamination and concentration
24 well plates (Plates Tissue 24 wells BD Falcon 35‐3047) Consumable Fisher 08-772-1 50 plates/case; for culture and reading
Sealable polythene bags 6 X 6 “ (ziplock) Consumable     for biosecurity to contain 24 well plate
Glass tubes with lid (16 x 100mm and 18 x 145mm) Consumable VWR 47729-583 500 tubes/case; to store aliquots of prepared broth
Screw cap microcentrifuge tubes (1.5ml) Consumable Fisher 05‐669‐22 1000ea/case; to store aliquots of antibiotic stocks
0.22μm filters (aqueous solvents) Syringe filter Millex blue Consumable Fisher SLGL 025 OS 50 units/case; to filter antibiotic stocks
0.22μm filters (organic solvents) Syringe filter Millex yellow Consumable Fisher SLGV 033 RS 50 units/case; to filter antibiotic stocks
Disposable Pasteur pipettes borosilicate glass 9″ Consumable Fisher 13‐678‐20C 720ea/case; to mix PANTA with media mix
Aerosol barrier tips 1000‐1300μl Consumable Fisher 02‐707‐51 1000ea/pk; to dispense media into plate
USA Scientific Tips One 1‐200μl yellow tips Consumable Fisher 1111‐0006 1000 tips/bag; to dilute antibiotic stocks

References

  1. Arias, M. Clinical evaluation of the microscopic-observation drug-susceptibility assay for detection of tuberculosis. Clin Infect Dis. 44, 674-674 (2007).
  2. Caviedes, L. Rapid, efficient detection and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in sputum by microscopic observation of broth cultures. The Tuberculosis Working Group in Peru. J Clin Microbiol. 38, 1203-1203 (2000).
  3. Caviedes, L., Moore, D. A. Introducing MODS: a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis. Indian J Med Microbiol. 25, 87-87 (2007).
  4. Caws, M. Evaluation of the MODS culture technique for the diagnosis of tuberculous meningitis. PLoS ONE. 2, e1173-e1173 (2007).
  5. Ejigu, G. S. Microscopic-observation drug susceptibility assay provides rapid and reliable identification of MDR-TB. Int J Tuberc Lung Dis. 12, 332-332 (2008).
  6. Kim, S. J. Risk of occupational tuberculosis in National Tuberculosis Programme laboratories in Korea. Int J Tuberc Lung Dis. 11, 138-138 (2007).
  7. Mello, F. C. Clinical evaluation of the microscopic observation drug susceptibility assay for detection of Mycobacterium tuberculosis resistance to isoniazid or rifampin. J Clin Microbiol. 45, 3387-3387 (2007).
  8. Moore, D. A. Future prospects for the MODS assay in multidrug-resistant tuberculosis diagnosis. Future Microbiol. 2, 97-97 (2007).
  9. Moore, D. A. Infrequent MODS TB culture cross-contamination in a high-burden resource-poor setting. Diagn Microbiol Infect Dis. 56, 35-35 (2006).
  10. Moore, D. A. Microscopic-observation drug-susceptibility assay for the diagnosis of TB. N Engl J Med. 355, 1539-1539 (2006).
  11. Moore, D. A. Microscopic observation drug susceptibility assay, a rapid, reliable diagnostic test for multidrug-resistant tuberculosis suitable for use in resource-poor settings. J Clin Microbiol. 42, 4432-4432 (2004).
  12. Moore, D. A., Roper, M. H. Diagnosis of smear-negative tuberculosis in people with HIV/AIDS. Lancet. 370, 1033-1033 (2007).
  13. Oberhelman, R. A. Improved recovery of Mycobacterium tuberculosis from children using the microscopic observation drug susceptibility method. Pediatrics. 118, e100-e100 (2006).
  14. Palomino, J. C., Martin, A., Portaels, F. MODS assay for the diagnosis of TB. N Engl J Med. 356, 188-189 (2007).
  15. Park, W. G., Bishai, W. R., Chaisson, R. E., Dorman, S. E. Performance of the microscopic observation drug susceptibility assay in drug susceptibility testing for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 40, 4750-4750 (2002).
  16. Shiferaw, G. Evaluation of microscopic observation drug susceptibility assay for detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 45, 1093-1093 (2007).
  17. Tovar, M. Improved diagnosis of pleural tuberculosis using the microscopic- observation drug-susceptibility technique. Clin Infect Dis. 46, 909-909 (2008).
  18. Vargas, D. Diagnosis of sputum-scarce HIV-associated pulmonary tuberculosis in Lima, Peru. Lancet. 365, 150-150 (2005).

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Cite This Article
Brady, M. F., Coronel, J., Gilman, R. H., Moore, D. A. The MODS method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis. J. Vis. Exp. (18), e845, doi:10.3791/845 (2008).

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