Summary
هذا الفيديو هو تظاهرة فنية للبروتوكول لتهجين كامل الجينوم تبليط الطريق CGH الصفيف ، الذي مسح الجينوم البشري بأكمله فقط باستخدام 25-100 نانوغرام من الحمض النووي يمكن أن يكون معزولا عن مجموعة متنوعة من المصادر ، بما في ذلك المواد الأرشيفية الثابتة الفورمالين.
Abstract
مجموعة التهجين الجينومي المقارن (CGH الصفيف) هو وسيلة للكشف عن المكاسب والخسائر في قطاعات الحمض النووي أو الجينات الدواء في الجينوم 1. وقد مكنت التطورات الحديثة في هذه التكنولوجيا العالية مقارنة الجينوم حل كامل لتحديد تغيرات جينية في حالات السرطان والأمراض الوراثية الأخرى 2. اللجنة الفرعية Megabase قرار تعيين مجموعة التبليط ، (أو SMRT) وتتألف مجموعة من مجموعة من حوالي 30000 تداخل الصبغي الاصطناعي البكتيري (BAC) التي تمتد استنساخ الجينوم البشري في ~ الزوج kilobase 100 (كيلوبايت) شرائح 2. وقد تم تجميع هذه الأهداف بشكل فردي ورصدت في BAC مكررة على شريحة زجاجية واحدة 2-4. وتستند مجموعة CGH على مبدأ التهجين تنافسية. وصفت وتفاضليا عينة الحمض النووي مع الإشارة 3 Cyanine والأصباغ الفلورية Cyanine - 5 ، وشاركت في المهجنة إلى الصفيف. بعد فترة حضانة المرض هي غسل العينات غير منضم من الشريحة والتقط الصفيف. يتم استخدام حزمة البرامج المتاحة بحرية مخصصة دعا SeeGH (www.flintbox.ca) لمعالجة حجم كبير من البيانات التي تم جمعها -- تجربة واحدة يولد 53892 نقاط البيانات. SeeGH يتصور قوة إشارة نسبة log2 بين عينات 2 في كل هدف BAC التي تتماشى مع موقف عموديا الكروموسومات 5،6. يمكن الكشف عن مجموعة SMRT تعديلات صغيرة مثل 50 كيلو بايت في حجم 7. لا يمكن للمجموعة SMRT كشف مجموعة متنوعة من الأحداث إعادة ترتيب الحمض النووي DNA بما في ذلك الأرباح والخسائر والتكبير والحذف متماثل. وهناك ميزة فريدة من الصفيف SMRT هو أن واحدة يمكن استخدام الحمض النووي المعزولة من عينات الفورمالين البارافين الثابتة المدمجة. عند دمجها مع متطلبات مدخلات منخفضة من الحمض النووي unamplified (25 100ng) يسمح هذا التنميط من العينات الثمينة مثل تلك التي تنتجها microdissection 7،8. ويعزى ذلك إلى حجم كبير من كل هدف التهجين BAC التي تسمح للربط ما يكفي لانتاج عينات المسمى إشارات للكشف. ميزة أخرى لهذا المنبر هو التسامح مع عدم تجانس الأنسجة ، وتقليل الحاجة إلى microdissection الأنسجة مملة 8. هذا البروتوكول الفيديو هو برنامج تعليمي خطوة بخطوة من وضع العلامات على الحمض النووي عن طريق إدخال إشارة إلى اقتناء لتبليط الجينوم SMRT مجموعة المسار.
Protocol
دقق وصفها
ملاحظة : الحد من التعرض للضوء ملونات Cye في جميع الأوقات (ويمكن تحقيق ذلك من خلال العمل في منطقة مظلمة أو عن طريق الأنابيب التدريع بغطاء مثل رقائق الألومنيوم)
- الجمع :
(1 الإعداد أنبوب رد فعل لتكون مرجعا و1 أنبوب رد فعل لعينة)- الحمض النووي (25-400 نانوغرام)
- 5 ميكرولتر من 5X العازلة الاشعال العشوائي (تركيز النهائي : 5X Promega Klenow العازلة وميكروغرام / 7 octamers عشوائي ميكرولتر)
- تمييع للحجم الإجمالي 17.0 ميكرولتر مع 2 المقطر O H
- يغلي لمدة 10 دقيقة عند 100 درجة مئوية. نقل على الفور إلى الجليد لمدة 1 دقيقة.
- إضافة 4 ميكرولتر من مزيج dNTP 10X (2mm وdATP ، dGTP ، dTTP ، dCTP 1.2mM).
- إضافة CyeDyes :
- إضافة 2 ميكرولتر (2 nmoles) من CY - 3 dCTP المسمى لعينة الحمض النووي
- إضافة 2 ميكرولتر (2 nmoles) من قبرصي 5 - dCTP المسمى DNA إلى المراجع (على سبيل المثال ، Novagen الحمض النووي الجينوم البشري)
- إضافة 2.5 ميكرولتر من Klenow (9 U / ميكرولتر ، Promega) ومزيج.
- احتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل * (~ 18 ساعة).
* يمكن ضبط الوقت التهجين بين عشية وضحاها ما بين 14 إلى 24 ساعة دون أن يؤثر ذلك سلبا على عملية وضع العلامات لتناسب لجدول زمني المختبر.
SAMPLE نظفوا
(الجامع للمسبار التنظيف والتحضير للتهجين)
- باستخدام YM - 30 Microcon العمود :
- إضافة 100 كوت - 1 ميكروليتر DNA (1μg/μL) إلى العمود. لا تلمس الغشاء مع تلميح ماصة.
- تجمع ردود الفعل (المرجعية والعينة) وإضافة إلى العمود.
- العمود مكان في المقدمة وأنبوب تدور ز 13000 لمدة 10 دقيقة.
- إضافة 200 H 2 0 ميكرولتر المقطر لغشاء تدور وكرر أن يغسل.
- تجاهل أنبوب وإضافة 45 ميكرولتر حل التهجين : (روش DIG سهلة)
- عكس Microcon ، ضع في أنبوب الجديد المسمى ، وتدور بسرعة 3000 غرام لمدة 3 دقائق.
حساب المعلومات المدرجة
- إزالة 1.5 ميكرولتر وقياس الطيف باستخدام دمج Fluorophore NanoDrop. التهجين باستخدام المخزن الخاص باعتبارها فارغة (DIG سهل) اتبع التعليمات على الشاشة. (يمكنك استعادة عينة من رمى ، إذا لزم الأمر ، وبعد القياس.)
(ملاحظة : المعلومات المدرجة أدناه بمول 3.0 / ميكرولتر في أي قناة وأظهرت النتائج متغير) - تفسد على 85 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- التحقيق في مكان 45 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة (كوت يسمح - 1 الحمض النووي الصلب).
ARRAY التهجين
- 44 حل مكان التحقيق وساترة على ميكرولتر (22 ملم × 60 ملم) (فيشر العلمية). إذا كانت متوفرة ، ضع ساترة على شريحة أو أكثر دفئا كتلة الحرارة قبل تحسنت إلى 45 درجة مئوية للحفاظ على درجة الحرارة.
- محاذاة على الشريحة ساترة وتحقيق الحل ، وانخفاض حافة واحدة من الشريحة السماح الاتصال مع الحل التهجين. تواصل انخفاض حتى يتم إرفاق ساترة إلى الشريحة مع التوتر السطحي. عكس الشريحة.
- ضع الشريحة في الكاسيت التهجين (Telechem) ، قبل أن درجة حرارة 45 درجة مئوية ، وإضافة 10 ميكرولتر من الماء في أسفل الأخدود (للتحكم في نسبة الرطوبة خلال التهجين).
- وختم الكاسيت احتضان لمدة 36 -- 40 ساعة عند 45 درجة مئوية.
ARRAY WASHING
ملاحظة : جميع الحلول ويغسل عند pH 7.0
إزالة الشريحة من الكاسيت التهجين أمر بالغ الأهمية. DIG سهل تبلور بسرعة في درجة حرارة الغرفة. يجب أن تكون الشريحة مغمورة فورا ، وإزالة الغطاء زلة في حل يغسل.
- إضافة ما يقرب من 60 مل من 0.1XSSC ، 0.1 ٪ SDS (الرقم الهيدروجيني 7.0 ، 45 درجة مئوية) يغسل حل لجرة Coplin قبل افتتاح غرفة التهجين.
- الغرفة مفتوحة ، إضافة إلى الشريحة غسل حل وإزالة ساترة (يجب أن الشريحة إيقاف).
- تغسل الشريحة 3 مرات في 0.1XSSC + 0.1 ٪ SDS في 45 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة مع كل الانفعالات.
- شطف الشريحة 3 مرات في 0.1XSSC جديدة *. وينبغي أن يكون هناك فقاعات المتبقية من غسل SDS مرئية.
* يمكن الشرائح تبقى في حل غسل النهائي حتى على استعداد لأجهزة الطرد المركزي والفحص (~ 15 دقيقة). - الطرد المركزي الشريحة في أنابيب فالكون 50 مل ب 700 غرام لمدة 3 دقائق.
- تفحص على الفور الشرائح (كثافات إشارة سيتقلص مع مرور الوقت.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والفقراء لا توفر نوعية الحمض النووي لمحة تهجين جيدة. فمن الضروري التأكد من أن عينة الحمض النووي ، ومرجعية تكون خالية من الملوثات ، مثل الحمض النووي الريبي ، والفينول ، والملح ، وغيرها التي قد تتداخل مع الخطوة العلامات رئيس عشوائي قبل البدء في تجربة التهجين. على سبيل المثال ، إعادة تعليق من الحمض النووي في تريس -- يمكن أن لا ينصح EDTA (TE) بدلا من الماء والملح تركيز عالية تمنع رد الفعل التوسيم. نوصي معايرة الجودة باستخدام الحمض النووي Nanodrop معمل لقياس كل من كمية الحمض النووي فضلا عن الشكل العام للمنحنى الامتصاصية و260/280 ، 260/230 النسبة.
الغسيل : إزالة الشريحة من الكاسيت التهجين ونقل الى حل غسل ساخنة هو خطوة حاسمة في عملية التهجين كحل DIG التهجين سهل تبلور بشكل سريع جدا. من المهم أن الحلول تكون في غسل محايد الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة من الحل غسل المهم بالنسبة الصرامة في حين إزالة التحقيق غير منضم. بعد تجفيف شرائح من المهم الاحتفاظ بها في الظلام إذا لم المسح على الفور ، أو بعد المسح إذا كنت ترغب في إعادة تفحص لهم في وقت لاحق.
الأوزون : الأوزون كانت مصدر قلق في جميع أنحاء العالم عند تنفيذ CGH الصفيف. وقد تبين أن مستويات الأوزون فوق 5ppm تؤثر سلبا على الأصباغ Cye. 5 Cye حساسة بشكل خاص للتدهور طبقة الأوزون. التقليل من التعرض الأوزون هو المفتاح لمنع تدهور وفقدان صبغة Cye إشارة قبل وأثناء المسح. المسح الضوئي ليلا على سبيل المثال ، عندما الأوزون البيئية أقل عادة ، هو أحد الخيارات الممكنة. مرفقات الأوزون مجانا للشريحة الغسيل الآلي والمسح الضوئي ومختلف العلاجات الكيميائية الشريحة متاحة تجاريا. الأصباغ Cye مقاومة الأوزون كما تم مؤخرا تطوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نود أن نشكر أعضاء فريق وان مختبر لام صفيف BAC خاصة ميوا سوزوكي وتشي بريان لإعداد هذا المقال. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة ، كندا الجينوم / الجينوم كولومبيا البريطانية ، والمعاهد الوطنية للصحة / NIDCR منح RO1 DE15965 - 01.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega Corp. | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega Corp. | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen, EMD Millipore | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega Corp. | ||
| YM-30 Column | Reagent | EMD Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche Group | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega Corp. | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays. BMC Genomics. 5, 6 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations. Human Genetics. 120, 795-805 (2007).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. SeeGH -- a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data. BMC Bioinformatics. 5, 13 (2004).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data. BMC Bioinformatics. 9, 243 (2008).
- Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. Resolving the resolution of array CGH. Genomics. 89, 647-653 (2007).
- Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples. Genomics. 85, 790-793 (2005).
