Summary
Este vídeo é uma demonstração técnica do protocolo de hibridização para todo o genoma azulejos caminho disposição CGH, que escaneia todo o genoma humano usando apenas 25-100 ng de DNA que podem ser isoladas a partir de uma variedade de fontes, incluindo o material de arquivo formol fixa.
Abstract
Matriz hibridização genômica comparativa (array CGH) é um método para a detecção de ganhos e perdas de segmentos de DNA ou dosagem do gene no genoma 1. Os recentes avanços nesta tecnologia permitiram a comparação de alta resolução de genomas inteiros para a identificação de alterações genéticas no cancro e outras doenças genéticas 2. O Sub-Megabase Resolução série Tiling set-(ou SMRT) matriz é composta por um conjunto de cerca de 30 mil sobreposição cromossomo artificial bacteriano (BAC) clones que abrangem o genoma humano em ~ par kilobase 100 (kb) segmentos 2. Essas metas são BAC individualmente sintetizados e manchado em duplicado por uma lâmina de vidro única 2-4. Matriz CGH é baseado no princípio de hibridização competitiva. Amostra de DNA e de referência são diferencialmente marcada com Cyanine-3 e corantes fluorescentes Cyanine-5, e co-hibridizados para a matriz. Após um período de incubação, as amostras não ligadas são lavadas a partir do slide ea matriz é impressa. Um pacote de software disponível gratuitamente personalizado chamado SeeGH (www.flintbox.ca) é usado para processar o grande volume de dados coletados - um único experimento gera 53.892 pontos de dados. SeeGH visualiza o log2 relação intensidade de sinal entre as duas amostras em cada alvo BAC, que está verticalmente alinhado com a posição cromossômica 5,6. A matriz SMRT pode detectar alterações tão pequenas quanto 50 kb de tamanho 7. A matriz SMRT pode detectar uma variedade de eventos de rearranjo do DNA DNA incluindo os ganhos, perdas, amplificações e deleções homozigótica. A única vantagem da matriz SMRT é que se pode usar DNA isolado de amostras de parafina fixado em formalina incorporado. Quando combinado com os requisitos de entrada baixa de DNA sem amplificação (25-100ng), que permite perfis de amostras preciosos como os produzidos por microdissecção 7,8. Isto é atribuído ao grande tamanho de cada alvo de hibridização BAC que permite a ligação de amostras suficientes rotulados para produzir sinais para detecção. Outra vantagem desta plataforma é a tolerância da heterogeneidade do tecido, diminuindo a necessidade de microdissecção tecido tedioso 8. Este protocolo de vídeo é um tutorial passo-a-passo da rotulagem o DNA de entrada até a aquisição de sinal para o genoma série azulejos toda SMRT caminho.
Protocol
PROBE ROTULAGEM
Nota: limite de exposição de Corantes Cye à luz o tempo todo (isso pode ser conseguido através do trabalho em uma área escura ou pela proteção dos tubos com uma tampa, como folha de alumínio)
- Combine:
(Setup um tubo de reação para referência e um tubo de reação para a amostra)- DNA (25-400 ng)
- 5 mL de tampão 5X primers aleatórios (concentração final: 5X Promega Klenow tampão e 7 mg / mL octâmeros aleatório)
- Diluída para 17,0 mL de volume total com H 2 O destilada
- Ferva por 10 minutos a 100 ° C. Transferir imediatamente para o gelo por 1 minuto.
- Adicionar 4 mL de dNTP mix 10X (2mM dATP, dGTP, dTTP, dCTP 1,2 mm).
- Adicionar CyeDyes:
- Adicione 2 mL (2 nmoles) de Cy-3 dCTP marcado com o DNA da amostra
- Adicione 2 mL (2 nmoles) de Cy-5 dCTP marcado para Referência DNA (por exemplo, Novagen DNA genômico humano)
- Adicionar 2,5 mL de Klenow (9 U / mL, Promega) e misturar.
- Incubar a 37 ° C durante a noite * (~ 18 horas).
* O tempo de hibridização durante a noite pode ser ajustada entre 14 a 24 horas sem afetar negativamente o processo de rotulagem para se adequar a um cronograma de laboratório.
AMOSTRA CLEAN UP
(Sonda combinada de limpeza e preparação para a hibridação)
- Usando um microcontrolador YM-30 coluna:
- Adicionar 100 Cot-1 mL DNA (1μg/μL) à coluna. Não toque membrana com pipeta ponta.
- Piscina as reações (de referência e amostra) e adicionar a coluna.
- Lugar na coluna tubo fornecido e girar à 13.000 g por 10 minutos.
- Adicionar 200 mL H 2 0 destilada e repetir a membrana de giro para lavagem.
- Descartar tubo e adicionar 45 mL de solução de hibridização: (Roche DIG Fácil)
- Inverter microcontrolador, coloque em um novo tubo rotulado, e girar a 3000 g por 3 minutos.
CÁLCULO de incorporações
- Remover 1,5 mL e incorporação medida fluoróforo usando Espectrofotômetro NanoDrop. Usando o seu tampão de hibridação como um espaço em branco (DIG Easy) siga as instruções na tela. (Você pode recuperar a amostra do pedestal, se necessário, após a medição.)
(Nota:. Incorporações abaixo de 3,0 pmol / mL nos dois canais têm mostrado resultados variáveis) - Desnaturar a 85 ° C por 10 minutos.
- Sonda lugar a 45 ° C por 30 minutos a 1 hora (permite Cot-1 DNA annealing).
HIBRIDIZAÇÃO ARRAY
- Coloque 44 mL de solução sonda sobre a lamínula (22 mm mm x 60) (Fisher Scientific). Se disponível, coloque a lamínula sobre uma lâmina quente ou bloco de aquecimento pré-aquecido a 45 ° C para manter a temperatura.
- Alinhar deslizar sobre lamínula e solução de sonda, uma borda inferior da lâmina permitindo contato com a solução de hibridação. Continue a diminuir até a lamela está ligado ao slide com tensão superficial. Inverter slide.
- Coloque o slide em cassete hibridação (Telechem), pré-aquecido a 45 ° C, e adicionar 10 mL de água na parte inferior do sulco (para controle de umidade durante a hibridação).
- Cassete Seal e incubar por 36-40 horas a 45 ° C.
LAVAGEM ARRAY
Nota: Todas as soluções de lavagem são em pH 7,0
Remoção da lâmina da cassete hibridação é crítica. DIG Fácil cristaliza rapidamente a temperatura ambiente. A lâmina deve ser imediatamente imersas ea lamínula removidos na solução de lavagem.
- Adicionar aproximadamente 60 mL de 0.1XSSC, 0,1% SDS (pH 7,0, 45 ° C) lavar solução para um frasco Coplin antes de abrir a câmara de hibridação.
- Câmara aberta, adicionar slides solução para lavar e remover lamela (deve escorregar).
- Lave o slide 3 vezes em 0.1XSSC + 0,1% SDS a 45 ° C por 1 minuto cada, com agitação.
- Lavar o slide 3 vezes em 0.1XSSC fresca *. Não deve haver bolhas residual da lavagem SDS visível.
* Os slides podem permanecer na solução de lavagem final até estar pronto para centrífuga e scan (~ 15 minutos). - Centrifugar o slide em uma tubos de 50 mL Falcon em 700 g por 3 minutos.
- Verificar imediatamente os slides (intensidades de sinal irá diminuir ao longo do tempo.)
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Discussion
Pobres DNA de qualidade não vai fornecer um perfil de hibridização bom. É essencial para garantir que a amostra de ADN de referência e estão livres de contaminantes tais como fenol, RNA, sal, etc que possam interferir com a etapa de rotulagem aleatória principal antes de iniciar um experimento de hibridização. Por exemplo, a ressuspensão de DNA em Tris - EDTA (TE) em vez de água não é recomendada como alta concentração de sal pode inibir a reação rotulagem. Recomendamos assaying qualidade do DNA usando o espectrofotômetro Nanodrop para medir tanto a quantidade de DNA, bem como forma geral da curva de absorbância e 260/280, 260/230 ratio.
Lavagem: Retirar a lâmina do cassete de hibridação e transferindo para a solução de lavagem aquecida é um passo crítico no processo de hibridização como a DIG solução de hibridização Fácil cristaliza muito rapidamente. É importante que as soluções de lavagem estar em um pH neutro ea temperatura da solução de lavagem é importante para o rigor durante a remoção da sonda desacoplado. Após a secagem slides, é importante mantê-los no escuro, se não a digitalização imediatamente, ou após a digitalização se quiser rescan-los em um momento posterior.
Ozônio: O ozônio tem sido uma preocupação mundial ao realizar CGH array. Os níveis de ozônio acima 5ppm foram mostrados para afetar adversamente as tinturas Cye. Cye 5 é particularmente sensível à degradação de ozônio. Minimizar a exposição do ozono é fundamental para prevenir a degradação do corante Cye e perda do sinal antes e durante a digitalização. Digitalização à noite por exemplo, quando o ozônio ambiental é normalmente inferior, é uma opção possível. Caixas de ozônio livre para deslizar automatizados lavagem e varredura e tratamentos químicos vários slides estão disponíveis comercialmente. Corantes de ozônio resistentes Cye, recentemente, também foram desenvolvidos.
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Acknowledgments
Queremos agradecer aos membros do Laboratório de Lam Wan equipe matriz BAC especialmente Miwa Suzuki e Bryan Chi para a preparação deste artigo. Este trabalho foi financiado com recursos do Canadian Institutes for Health Research, Canadá Genoma / British Columbia Genoma, e NIH / NIDCR conceder RO1 DE15965-01.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega Corp. | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega Corp. | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen, EMD Millipore | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega Corp. | ||
| YM-30 Column | Reagent | EMD Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche Group | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega Corp. | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
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