Summary
このビデオでは、アーカイブホルマリン固定材料など、さまざまなソースから単離することができるDNAの唯一の25から100 ngを用いてヒトゲノム全体をスキャンして全ゲノムタイリングのパスアレイCGH、のためのハイブリダイゼーションプロトコルの技術的なデモンストレーションです。
Abstract
アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）はゲノム1のDNAセグメントまたは遺伝子量の損益を検出する方法です。この技術の最近の進歩により、がんやその他の遺伝性疾患2の遺伝子変異の同定のための全ゲノムの高解像度の比較を有効にしている。サブメガベース解像度タイルセットの配列（またはSMRT）の配列は、約100キロベースペア（KB）のセグメント2をヒトゲノムにまたがる約3万重複する細菌人工染色体（BAC）クローンのセットで構成されます。これらのBACの目標は、個々に合成し、単一のガラススライド2-4二重にスポットされています。アレイCGHは、競合ハイブリダイゼーションの原理に基づいています。サンプルとリファレンスのDNAは、差動シアニン- 3で標識し、シアニン- 5蛍光色素、及び配列に共同ハイブリダイズさせる。潜伏期間の後にバインドされていないサンプルは、スライドから洗浄され、配列が結像される。 SeeGH（www.flintbox.ca）と呼ばれる自由に利用できるカスタムソフトウェアパッケージは、収集した大量のデータを処理するために使用されます - 単一の実験では、53892のデータポイントを生成します。 SeeGHは垂直に染色体の位置を5,6に整列されている各BACのターゲットで2サンプル間のLOG2信号の強度比を可視化する。 SMRTの配列は、サイズ7の50キロバイトのような小さな変化を検出することができます。 SMRTの配列は、DNAの利益、損失、増幅およびホモ接合の欠失を含むDNA再構成のさまざまなイベントを検出することができます。 SMRTの配列のユニークな利点は1つが、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルから単離されたDNAを使用できることです。非増幅DNA（25 - 100ng）の低入力要件と組み合わせるとこのようなマイクロダイセクション7,8で生成されるものとして貴重なサンプルのプロファイリングが可能になります。これは、十分な標識サンプルの結合は検出のための信号を生成することができます各BACのハイブリダイゼーションのターゲットの大きなサイズに起因する。このプラットフォームのもう一つの利点は、退屈な組織マイクロダイセクション8の必要性を減少させる、組織の不均一性の許容範囲です。このビデオプロトコルは、全ゲノムのタイルのパスのSMRTの配列のために買収を通知することによって入力のDNAをラベリングからステップバイステップのチュートリアルです。
Protocol
プローブラベリング
注：常に光にCYE染料の限界露出（これは暗い領域で作業するか、アルミ箔等のカバーでチューブを保護することによって達成することができます）
- 組み合わせる：
（リファレンスとサンプルは1反応管のためのセットアップ1反応チューブ）- DNA（25〜400 ng）を
- 5Xランダムプライマーの緩衝液5μL（最終濃度：5Xプロメガクレノーバッファおよび7μg/μLのランダム八量体）
- 蒸留H 2 Oと17.0μL、総容積に希釈する
- 100℃10分間沸騰℃に1分間氷にすぐに転送する。
- 10X dNTPミックス（2mMのdATPを用い、dGTPを、dTTPの、さ1.2mm dCTPを）4μLを加える。
- CyeDyesを追加します。
- サンプルDNAへのCy - 3標識dCTPの2μLを（2ナノモル）追加
- リファレンスDNA（例えば、Novagen社のヒトゲノムDNA）へのCy - 5標識dCTPの2μLを（2ナノモル）追加
- 2.5クレノウのμL（9 U /μL、プロメガ社製）とミックスを追加。
- 37℃で一晩*（〜18時間）。
*一晩ハイブリダイゼーションの時間に悪影響を実験室のスケジュールに合わせてラベルのプロセスに影響を与えることなく、14〜24時間の間で調整することができます。
SAMPLEをクリーンアップ
（ハイブリダイゼーション用プローブのクリーンアップと準備の組み合わせ）
- マイクロコンYM - 30カラムを使用する：
- カラムに100μLCOT - 1 DNA（1μg/μL）を追加します。ピペットチップでメンブレンに触れないでください。
- プール反応（リファレンスとサンプル）とカラムに追加します。
- 10分間13000グラムで提供されるチューブやスピンで列を置きます。
- 膜に200μLの蒸留H 2 0を追加し、洗うようにスピンを繰り返します。
- チューブを廃棄し、45μLハイブリダイゼーション溶液を追加：（ロシュのDIG Easy）
- マイクロコン、新しいラベルが付いたチューブの場所、および3分間3000gでスピン反転。
法人設立の計算
- 1.5μLと光度計分光光度計を用いて測定する蛍光物質の混入を取り外します。ブランクとしてハイブリダイゼーションバッファーを用いて（DIGイージー）画面の指示に従います。 （必要に応じて測定後、台座からサンプルを回復することができます。）
（ 注：いずれかのチャネルでは3.0ピコモル/μL以下の法人設立には、変数の結果を示している。） - 85変性℃で10分間。
- 45℃の場所プローブ° C 30分〜1時間（COT - 1 DNAのアニーリングが可能。）用
アレイハイブリダイゼーション
- カバースリップ上に場所44μLプローブ溶液（22ミリメートル× 60ミリメートル）（フィッシャーサイエンティフィック）。利用可能な場合は、スライド上に暖かいまたはヒートブロック℃の温度を維持するために45に予め温めておいたカバーを置きます。
- カバースリップとプローブ溶液上にスライド、ハイブリダイゼーション溶液との接触を可能にするスライドのうち低い方の端を合わせます。カバースリップが表面張力でスライドにアタッチされるまで下げるために引き続き。スライドを反転。
- ハイブリダイゼーションカセット（Telechem）、事前に温め、45 ° C、及び（ハイブリダイゼーションの間に湿度を制御するために）下の溝に水を10μLを追加するにスライドを置きます。
- 36のシールのカセットとインキュベート - 45℃40時間℃、
洗濯ARRAY
注：すべての洗浄溶液は、pH7.0でいる
ハイブリダイゼーションカセットからスライドの除去は重要です。のDIG Easyは、すぐに室温で結晶化する。スライドはすぐに浸漬し、カバーガラスは洗浄溶液で除去する必要があります。
- 約60 0.1XSSC mLを加え、0.1％SDS液（pH7.0、45℃）ハイブリダイゼーションチャンバーを開く前にコプリンジャーにソリューションを洗う。を追加
- ソリューションを洗浄し、（それがオフにスライドしてください）カバースリップを削除するスライドを追加し、チャンバーオープン。
- ℃1分ごとに攪拌しながらスライドを0.1XSSCで3回+ 45 0.1％SDSを洗ってください。
- 新鮮な0.1XSSCでスライドを3回すすいでください*.目に見えるSDSの洗浄からの残留気泡がないはずです。
*スライドは、遠心分離し、（〜15分）をスキャンする準備ができるまで、最後の洗浄溶液中に残ることができる。 - 3分間、700 gで50 mLのファルコンチューブにスライドを遠心分離します。
- すぐに（信号強度が時間と共に低下します。）スライドをスキャン
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Discussion
低品質のDNAは、適切なハイブリダイゼーションのプロファイルを提供することはありません。それはそのサンプルとリファレンスDNAを確保するために不可欠であるようなハイブリダイゼーション実験を開始する前に、ランダムプライムラベリングステップを妨げる可能性フェノール、RNA、塩、等のような汚染物質から自由である。例えば、トリスのDNAの再懸濁 - 水の代わりにEDTA（TE）は、高塩濃度として推奨されていないが標識反応を阻害することができる。我々はDNAの量だけでなく、全体の吸光度曲線の形と280分の260、230分の260の比率の両方を測定する光度計分光光度計を用いてDNAの品質を測定することをお勧めします。
洗濯：ハイブリダイゼーションカセットからスライドを削除し、加熱された洗浄液に移すことがDIG Easyハイブリダイゼーション溶液は非常に迅速に結晶化するようにハイブリダイゼーションプロセスの重要なステップです。それは、洗浄溶液のpHが中性になることが重要であると結合していないプローブを除去しながら洗浄溶液の温度は、厳しさのために重要です。スライドを乾燥させた後、それはすぐにスキャンしていない場合、またはあなたが後でそれらを再スキャンする場合、スキャン後、暗所でそれらを保つことが重要です。
オゾン：アレイCGHを実行するときにオゾンが世界的な関心事となっている。 5ppmを上記のオゾンレベルはCYE染料に悪影響を及ぼすことが示されている。 CYE 5はオゾン劣化に特に敏感である。オゾン暴露を最小限に抑えることはCYE色素劣化やスキャンの実行前および実行中に、信号の損失を防止するための鍵です。例えば、夜間にスキャンを、環境オゾンは一般的に低い場合に、1つの可能なオプションです。自動スライドのためのオゾンフリー筐体の洗浄およびスキャンして、様々な化学のスライドの治療は、市販されている。オゾン耐性CYEの染料はまた、最近開発されている。
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Acknowledgments
我々は、この記事の準備のために特にWANラムラボBACアレイのチームのメンバー三輪鈴木とブライアンホーチミンに感謝したい。この作品は、ヘルスリサーチ、ゲノムカナダ/ゲノムブリティッシュコロンビア州、およびNIH / NIDCR助成金RO1 DE15965 - 01のためのカナダの協会からの資金によって支えられている。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega Corp. | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega Corp. | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen, EMD Millipore | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega Corp. | ||
| YM-30 Column | Reagent | EMD Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche Group | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega Corp. | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays. BMC Genomics. 5, 6 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations. Human Genetics. 120, 795-805 (2007).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. SeeGH -- a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data. BMC Bioinformatics. 5, 13 (2004).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data. BMC Bioinformatics. 9, 243 (2008).
- Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. Resolving the resolution of array CGH. Genomics. 89, 647-653 (2007).
- Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples. Genomics. 85, 790-793 (2005).
