Summary
Cette vidéo est une démonstration technique du protocole d'hybridation pour l'ensemble du génome de carrelage CGH array chemin, qui scanne l'ensemble du génome humain en utilisant seulement 25 à 100 ng d'ADN qui peuvent être isolées à partir de diverses sources, y compris les archives du matériel fixé au formol.
Abstract
Hybridation génomique comparative (CGH array) est une méthode pour détecter les gains et pertes de segments d'ADN ou le dosage des gènes dans le génome 1. Les avancées récentes dans cette technologie ont permis de comparaison haute résolution des génomes entiers pour l'identification d'altérations génétiques dans le cancer et autres maladies génétiques 2. Le Sous-Megabase Résolution Carrelage-set tableau (ou SMRT) tableau est composé d'un ensemble d'environ trente mille bactéries qui se chevauchent chromosomes artificiels (BAC) des clones qui couvrent le génome humain en ~ 100 paires kilobases (kb) des segments 2. Ces cibles d'alcoolémie sont individuellement synthétisés et repéré en double sur une lame de verre simple 2-4. CGH array est basé sur le principe de l'hybridation compétitive. Des échantillons et l'ADN de référence sont étiquetés avec différentiel Cyanine-3 et colorants de cyanine-5 fluorescentes, et co-hybride à la matrice. Après une période d'incubation de l'échantillon non liés sont lavés de la diapositive et le tableau est imagé. Un logiciel librement disponible personnalisé appelé SeeGH (www.flintbox.ca) est utilisé pour traiter l'important volume de données recueillies - une expérience unique génère 53 892 points de données. SeeGH visualise le ratio d'intensité de signal entre le log2 2 échantillons à chaque cible d'alcoolémie qui est aligné verticalement avec la position chromosomique 5,6. Le tableau SMRT peut détecter des altérations aussi petite que 50 kb 7. Le tableau SMRT peut détecter une variété d'événements réarrangement d'ADN y compris les gains d'ADN, des pertes, des amplifications et délétions homozygotes. Un avantage unique de la matrice de SMRT est que l'on peut utiliser l'ADN isolé à partir d'échantillons de paraffine fixés au formol embarqués. Lorsqu'il est combiné avec les exigences d'entrée faible de l'ADN non amplifié (25-100 ng) ce qui permet le profilage des échantillons précieux tels que ceux produits par microdissection 7,8. Ceci est attribué à la grande taille de chacune des cibles hybridation BAC, qui permet la liaison de suffisamment d'échantillons étiquetés pour produire des signaux pour la détection. Un autre avantage de cette plateforme est la tolérance de l'hétérogénéité des tissus, en diminuant le besoin de microdissection tissulaire fastidieuse 8. Ce protocole est un tutoriel vidéo étape par étape, de marquage de l'ADN d'entrée grâce à l'acquisition du signal pour le tableau du génome de carrelage SMRT toute voie.
Protocol
SONDE D'ETIQUETAGE
Remarque: limiter l'exposition des Colorants Cye à la lumière, à tout moment (cela peut être réalisé en travaillant dans une zone obscurcie ou en protégeant les tubes avec une couverture comme le papier d'aluminium)
- Combiner:
(Configuration 1 tube de réaction pour référence et 1 tube de réaction pour l'échantillon)- L'ADN (25-400 ng)
- 5 pi de tampon 5X amorces aléatoires (concentration finale: 5X Promega Klenow tampon et 7 pg / uL octamères aléatoire)
- Diluer à 17,0 volume total d'eau distillée uL H 2 O
- Faire bouillir pendant 10 minutes à 100 ° C. Transfert immédiatement à la glace pendant 1 minute.
- Ajouter 4 pi de mélange dNTP 10X (2 mM de dATP, dGTP, dTTP, dCTP 1,2 mm).
- Ajouter CyeDyes:
- Ajouter 2 uL (2 nmoles) de Cy-3 dCTP marqués à l'ADN échantillon
- Ajouter 2 uL (2 nmoles) de Cy-5 étiqueté dCTP à l'ADN de référence (par exemple, l'ADN génomique humain Novagen)
- Ajouter 2,5 pi de Klenow (9 U / uL, Promega) et mélanger.
- Incuber à 37 ° C pendant la nuit * (~ 18 heures).
* Le temps d'hybridation pendant la nuit peut être ajustée entre 14 à 24 heures sans affecter négativement le processus d'étiquetage pour s'adapter à un horaire de laboratoire.
Purification de l'échantillon
(Sonde combinée de nettoyage et de préparation à l'hybridation)
- L'utilisation d'un Microcon YM-30 colonne:
- Ajouter 100 Cot-1 uL d'ADN (1μg/μL) à la colonne. Ne pas toucher la membrane avec la pointe de pipette.
- Piscine les réactions (référence et échantillon) et ajouter à la colonne.
- Colonne de la Place dans le tube fourni et centrifuger à 13000 g pendant 10 minutes.
- Ajouter 200 ul distillée H 2 0 à la membrane et répéter spin pour se laver.
- Jeter le tube et ajouter 45 uL solution d'hybridation: (Roche DIG Easy)
- Inverser Microcon, placer dans un nouveau tube étiqueté, et tournent à 3000 g pendant 3 minutes.
CALCUL DU INCORPORATIONS
- Retirez 1,5 uL et l'incorporation fluorophore mesurer à l'aide Spectrophotomètre NanoDrop. Utilisation de votre tampon d'hybridation comme une vierge (DIG Easy) suivez les instructions à l'écran. (Vous pouvez récupérer l'échantillon du piédestal, si nécessaire, après la mesure.)
(Remarque:. Incorporations inférieur à 3,0 pmol / uL dans deux canaux ont montré des résultats variables) - Dénaturer à 85 ° C pendant 10 minutes.
- Placez la sonde à 45 ° C pendant 30 minutes à 1 heure (Cot-1 permet l'ADN recuit.)
HYBRIDATION ARRAY
- Placer 44 uL solution de sonde sur la lamelle (22 mm x 60 mm) (Fisher Scientific). Si possible, placer la lamelle sur une lame chaude ou de bloquer la chaleur pré-chauffé à 45 ° C pour maintenir la température.
- Aligner glisser sur la lamelle et solution de sonde, la baisse d'un bord de la diapositive permettant le contact avec la solution d'hybridation. Continuer d'abaisser jusqu'à ce que la lamelle est attaché à la lame avec la tension de surface. Inverser la diapositive.
- Placer la lame dans la cassette d'hybridation (Telechem), pré-chauffé à 45 ° C, et ajouter 10 uL d'eau dans la rainure inférieure (pour contrôler l'humidité lors de l'hybridation).
- Cassette Seal et incuber pendant 36 - 40 heures à 45 ° C.
LAVAGE ARRAY
Note: Toutes les solutions de lavage sont à pH 7,0
Retrait de la glissière de la cassette hybridation est critique. DIG Facile cristallise rapidement à température ambiante. La lame doit être immédiatement immergé et la lamelle enlevée dans la solution de lavage.
- Ajouter environ 60 ml d'0.1XSSC, SDS 0,1% (pH 7,0, 45 ° C) la solution de lavage à une jarre de Coplin avant l'ouverture de la chambre d'hybridation.
- Ouvrez la chambre, ajoutez diapositive à la solution de lavage et enlever la lamelle (il faut glisser).
- Laver la lame 3 fois dans 0.1XSSC + 0,1% SDS à 45 ° C pendant 1 minute chacun avec agitation.
- Rincer la lame 3 fois dans 0.1XSSC frais *. Il devrait y avoir aucune bulle résiduelle de la SDD se laver visibles.
* Les diapositives peuvent rester dans la solution de lavage final jusqu'au moment de centrifugeuses et de numérisation (~ 15 minutes). - Centrifuger la lame dans un des tubes de 50 ml Falcon à 700 g pendant 3 minutes.
- Immédiatement numériser les diapositives (intensités du signal diminue avec le temps.)
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Discussion
La mauvaise qualité de l'ADN ne fournira pas un profil d'hybridation bien. Il est essentiel de s'assurer que l'échantillon d'ADN de référence et sont exempts de contaminants tels que le phénol, l'ARN, le sel, etc qui peuvent interférer avec l'étape de marquage Premier aléatoire avant de commencer une expérience d'hybridation. Par exemple, la remise en suspension de l'ADN dans Tris - EDTA (TE) au lieu de l'eau n'est pas recommandée car la concentration en sel élevée peut inhiber la réaction de marquage. Nous vous recommandons de doser qualité de l'ADN en utilisant le spectrophotomètre Nanodrop pour mesurer la quantité d'ADN ainsi que la forme générale de la courbe de l'absorbance et le 260/280, 260/230 ratio.
Lavage: Retrait de la lame de la cassette d'hybridation et le transfert de la solution de lavage chauffée est une étape cruciale dans le processus de l'hybridation comme la solution DIG hybridation facile cristallise très rapidement. Il est important que les solutions de lavage soit à un pH neutre et la température de la solution de lavage est important pour la rigueur tout en retirant la sonde non liée. Après séchage diapositives, il est important de les garder dans le noir si elle n'est pas la numérisation immédiatement, ou après numérisation, si vous souhaitez les réanalyser à une date ultérieure.
Ozone: L'ozone a été une préoccupation dans le monde entier lors de l'exécution de CGH array. Les niveaux d'ozone au-dessus de 5 ppm a été démontré que de nuire à des colorants Cye. Cye 5 est particulièrement sensible à la dégradation de la couche d'ozone. Minimiser exposition à l'ozone est essentielle pour prévenir la dégradation Cye colorant et de perte du signal avant et pendant la numérisation. Balayage de nuit par exemple, lorsque la couche d'ozone sur l'environnement est généralement plus faible, est une option possible. Enceintes ozone gratuit pour glisser automatique pour le lavage et le balayage et divers traitements chimiques slide sont disponibles commercialement. Colorants ozone Cye résistants ont aussi été récemment développés.
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Acknowledgments
Nous tenons à remercier les membres de l'équipe de Wan Lam Lab tableau BAC particulier Miwa Suzuki et Bryan Chi pour la préparation de cet article. Ce travail a été soutenu par des fonds des Instituts canadiens de recherche en santé, Génome Canada / Génome Colombie-Britannique, et le NIH / NIDCR octroi RO1 DE15965-01.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega Corp. | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega Corp. | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen, EMD Millipore | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega Corp. | ||
| YM-30 Column | Reagent | EMD Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche Group | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega Corp. | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).
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- Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. Resolving the resolution of array CGH. Genomics. 89, 647-653 (2007).
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