هذا الفيديو هو تظاهرة فنية للبروتوكول لتهجين كامل الجينوم تبليط الطريق CGH الصفيف ، الذي مسح الجينوم البشري بأكمله فقط باستخدام 25-100 نانوغرام من الحمض النووي يمكن أن يكون معزولا عن مجموعة متنوعة من المصادر ، بما في ذلك المواد الأرشيفية الثابتة الفورمالين.
مجموعة التهجين الجينومي المقارن (CGH الصفيف) هو وسيلة للكشف عن المكاسب والخسائر في قطاعات الحمض النووي أو الجينات الدواء في الجينوم 1. وقد مكنت التطورات الحديثة في هذه التكنولوجيا العالية مقارنة الجينوم حل كامل لتحديد تغيرات جينية في حالات السرطان والأمراض الوراثية الأخرى 2. اللجنة الفرعية Megabase قرار تعيين مجموعة التبليط ، (أو SMRT) وتتألف مجموعة من مجموعة من حوالي 30000 تداخل الصبغي الاصطناعي البكتيري (BAC) التي تمتد استنساخ الجينوم البشري في ~ الزوج kilobase 100 (كيلوبايت) شرائح 2. وقد تم تجميع هذه الأهداف بشكل فردي ورصدت في BAC مكررة على شريحة زجاجية واحدة 2-4. وتستند مجموعة CGH على مبدأ التهجين تنافسية. وصفت وتفاضليا عينة الحمض النووي مع الإشارة 3 Cyanine والأصباغ الفلورية Cyanine – 5 ، وشاركت في المهجنة إلى الصفيف. بعد فترة حضانة المرض هي غسل العينات غير منضم من الشريحة والتقط الصفيف. يتم استخدام حزمة البرامج المتاحة بحرية مخصصة دعا SeeGH (www.flintbox.ca) لمعالجة حجم كبير من البيانات التي تم جمعها — تجربة واحدة يولد 53892 نقاط البيانات. SeeGH يتصور قوة إشارة نسبة log2 بين عينات 2 في كل هدف BAC التي تتماشى مع موقف عموديا الكروموسومات 5،6. يمكن الكشف عن مجموعة SMRT تعديلات صغيرة مثل 50 كيلو بايت في حجم 7. لا يمكن للمجموعة SMRT كشف مجموعة متنوعة من الأحداث إعادة ترتيب الحمض النووي DNA بما في ذلك الأرباح والخسائر والتكبير والحذف متماثل. وهناك ميزة فريدة من الصفيف SMRT هو أن واحدة يمكن استخدام الحمض النووي المعزولة من عينات الفورمالين البارافين الثابتة المدمجة. عند دمجها مع متطلبات مدخلات منخفضة من الحمض النووي unamplified (25 100ng) يسمح هذا التنميط من العينات الثمينة مثل تلك التي تنتجها microdissection 7،8. ويعزى ذلك إلى حجم كبير من كل هدف التهجين BAC التي تسمح للربط ما يكفي لانتاج عينات المسمى إشارات للكشف. ميزة أخرى لهذا المنبر هو التسامح مع عدم تجانس الأنسجة ، وتقليل الحاجة إلى microdissection الأنسجة مملة 8. هذا البروتوكول الفيديو هو برنامج تعليمي خطوة بخطوة من وضع العلامات على الحمض النووي عن طريق إدخال إشارة إلى اقتناء لتبليط الجينوم SMRT مجموعة المسار.
والفقراء لا توفر نوعية الحمض النووي لمحة تهجين جيدة. فمن الضروري التأكد من أن عينة الحمض النووي ، ومرجعية تكون خالية من الملوثات ، مثل الحمض النووي الريبي ، والفينول ، والملح ، وغيرها التي قد تتداخل مع الخطوة العلامات رئيس عشوائي قبل البدء في تجربة التهجين. على سبيل المثال ، إعا?…
نود أن نشكر أعضاء فريق وان مختبر لام صفيف BAC خاصة ميوا سوزوكي وتشي بريان لإعداد هذا المقال. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة ، كندا الجينوم / الجينوم كولومبيا البريطانية ، والمعاهد الوطنية للصحة / NIDCR منح RO1 DE15965 – 01.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
5X Klenow Buffer | Reagent | Promega | ||
Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
10X dNTP mix | Reagent | Promega | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen | Example of a possible reference | |
Klenow | Reagent | Promega | ||
YM-30 Column | Reagent | Millipore | ||
Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
DIG Easy | Reagent | Roche | ||
Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega | ||
Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
Hybridization Cassette | Tool | Telechem |