Summary
סרט הווידאו הזה הוא הפגנה טכני של פרוטוקול הכלאה עבור כל ריצוף הגנום נתיב מערך CGH, שסורקת את הגנום האנושי כולו רק באמצעות 25-100 ng של DNA כי ניתן לבודד מתוך מגוון של מקורות, כולל חומר ארכיוני קבוע פורמלין.
Abstract
גנומית השוואתי מערך ההכלאה (מערך CGH) היא שיטה לגילוי הרווחים וההפסדים של מגזרים דנ"א או מינון גנים הגנום 1. ההתקדמות בטכנולוגיה זו אפשרו השוואה ברזולוציה גבוהה של הגנום כולו לזיהוי שינויים גנטיים בסרטן ומחלות גנטיות אחרות 2. תת Megabase ריצוף שנקבע בהחלטה מערך (או SMRT) מערך מורכב של קבוצה של כ 30,000 חופפים כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) שיבוטים כי ההיקף הגנום האנושי בזוג ~ kilobase 100 (KB) 2 קטעים. מטרות אלה BAC מסונתזים בנפרד הבחין בשני עותקים על זכוכית שקופית אחת 2-4. Array CGH מבוססת על העיקרון של הכלאה תחרותי. לדוגמה ו-DNA התייחסות מסומנים באופן דיפרנציאלי עם Cyanine-3 ואת צובעת Cyanine-5 ניאון, ושיתוף הכלאה למערך. לאחר תקופת דגירה הדגימות מאוגד נשטפים משקופית ואת מערך היא הדמיה. חבילת זמין בחינם תוכנות מותאמות אישית בשם SeeGH (www.flintbox.ca) משמש כדי תהליך נפח גדול של נתונים שנאספו - ניסוי אחד מייצר 53,892 נקודות נתונים. SeeGH מדמיין את האות log2 עוצמת היחס בין 2 דגימות בכל מטרה BAC אשר מיושרים אנכית עם עמדת כרומוזומליות 5,6. מערך SMRT יכול לזהות שינויים קטנים כמו 50 KB בגודל 7. מערך SMRT יכול לזהות מגוון של סידור אירועים DNA לרבות רווחים DNA, הפסדים ומחיקות amplifications הומוזיגוטים. יתרון ייחודי של המערך SMRT היא שאף אחד יכול להשתמש DNA שבודד פורמלין דגימות פרפין קבוע מוטבע. בשילוב עם דרישות קלט נמוך של ה-DNA unamplified (25 100ng) זה מאפשר אפיון של דגימות יקרות כמו אלה המיוצרים על ידי microdissection 7,8. זו מיוחסת גודלו של כל יעד הכלאה BAC המאפשר קשירה של דגימות שכותרתו מספיק כדי לייצר אותות לצורך זיהוי. יתרון נוסף של הפלטפורמה הזו היא סובלנות ההטרוגניות של רקמות, הקטנת הצורך microdissection רקמות משעמם 8. זה פרוטוקול וידאו הדרכה צעד אחר צעד מהתווית DNA קלט דרך לאותת הרכישה עבור מערך שלם ריצוף הגנום נתיב SMRT.
Protocol
בדיקה סימון
הערה: להגביל את החשיפה של צבעים Cye לאור בכל הזמנים (זו יכולה להיות מושגת על ידי עבודה באזור חשוך או על ידי מיגון צינורות עם כיסוי כמו רדיד אלומיניום)
- שלב:
(Setup 1 שפופרת תגובה עבור התייחסות 1 שפופרת התגובה למדגם)- DNA (25-400 נ"ג)
- 5 μL של חיץ primers 5X אקראית (ריכוז סופי: 5X Promega Klenow חוצץ ו 7 מיקרוגרם / octamers אקראי μL)
- מדולל נפח 17.0 הכולל μL מזוקקים עם H 2 O
- מרתיחים במשך 10 דקות ב 100 ° C. העברה מיידית קרח למשך דקה 1.
- הוסף 4 μL תמהיל dNTP 10X (2mm dATP, dGTP, dTTP, dCTP 1.2 מ"מ).
- הוסף CyeDyes:
- הוסף μL 2 (2 nmoles) של dCTP סיי-3 שכותרתו ל-DNA Sample
- הוסף μL 2 (2 nmoles) של סיי-5 dCTP שכותרתו הפניה DNA (למשל, ה-DNA הגנומי Novagen אדם)
- הוסף 2.5 μL של Klenow (9 U / μL, Promega) ומערבבים.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה * (~ 18 שעות).
* הפעם הכלאה בין לילה יכול להיות מותאם בין 14 ל -24 שעות מבלי להשפיע לרעה על תהליך תיוג כדי להתאים ללוח הזמנים מעבדה.
דוגמא CLEAN UP
(בשילוב בדיקה לנקות והכנה הכלאה)
- שימוש YM-30 Microcon עמודה:
- הוספת 100 Cot-1 μL DNA (1μg/μL) לעמודה. אל תיגע קרום עם טפטפת בקצה.
- בריכת התגובות (התייחסות לדוגמה) ולהוסיף עמודה.
- המקום עמודה צינור סיפק ספין ב g 13,000 במשך 10 דקות.
- הוספת 200 H מזוקקים μL 2 0 עד קרום וחזור ספין לשטוף.
- בטל צינור ולהוסיף 45 פתרון הכלאה μL: (רוש DIG קל)
- היפוך Microcon, מקום צינור שכותרתו חדשים, ספין על 3000 גרם במשך 3 דקות.
חישוב INCORPORATIONS
- הסר 1.5 μL ו Fluorophore למדוד ההתאגדות באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop. באמצעות המאגר הכלאה שלך ריק (DIG קל) בצע את ההוראות על המסך. (ניתן לשחזר את הדוגמה הכן, במידת הצורך, לאחר מדידה).
(הערה:. Incorporations מתחת 3.0 pmol / μL בערוץ גם הראו התוצאות משתנה) - לפגל על 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- מקום בדיקה ב 45 ° C במשך שעה 30 דקות עד 1 (מאפשר Cot-1-DNA חישול).
ARRAY הכלאה
- 44 מקום פתרון μL בדיקה על coverslip (22 מ"מ x 60 מ"מ) (פישר סיינטיפיק). אם זמין, המקום coverslip בשקופית חם או לחסום חום טרום חימם עד 45 ° C כדי לשמור על הטמפרטורה.
- יישר להחליק על coverslip פתרון בדיקה, נמוך קצה אחד של שקופיות המאפשר מגע עם הפתרון הכלאה. המשך נמוך עד coverslip מצורף לשקופית עם מתח הפנים. היפוך שקופיות.
- מניחים את השקופית לתוך קלטת הכלאה (Telechem), טרום חימם עד 45 ° C, ולהוסיף 10 μL מים החריץ התחתון (כדי לשלוט לחות במהלך הכלאה).
- חותם קלטת ו דגירה של 36-40 שעות ב 45 ° C.
ARRAY כביסה
הערה: כל פתרונות לשטוף הם ב-pH 7.0
הסרה של השקופית מתוך הקלטת ההכלאה היא קריטית. DIG קל במהירות מתגבש בטמפרטורת החדר. שקופית צריך להיות שקוע מיד את הפתק מכסה הסיר בפתרון לשטוף.
- הוספת כ 60 מ"ל של 0.1XSSC, 0.1% SDS (pH 7.0, 45 ° C) לשטוף פתרון בצנצנת Coplin לפני פתיחת תא הכלאה.
- תא פתוח, להוסיף שקופית לשטוף ולהסיר פתרון coverslip (הוא אמור להחליק).
- לשטוף את השקופית 3 פעמים 0.1XSSC + SDS 0.1% ב 45 ° C למשך דקה 1 כל אחד עם תסיסה.
- יש לשטוף את השקופית 3 פעמים 0.1XSSC טריים *. לא צריך להיות שום בועות שיורית מן לשטוף את SDS גלוי.
* שקופיות יכול להישאר הפתרון הסופי עד לשטוף מוכן צנטריפוגות ולסרוק (~ 15 דקות). - צנטריפוגה את השקופית 50 צינורות מ"ל פלקון 700 גרם ב 3 דקות.
- מיד לסרוק את השקופיות (עוצמות אות תפחת לאורך זמן.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA באיכות ירודה לא תספק פרופיל הכלאה טובה. זה חיוני כדי להבטיח כי המדגם ו-DNA הפניה ללא מזהמים כגון פנול, RNA, מלח, וכו 'שעשויים להפריע צעד תיוג אקראי הממשלה לפני תחילת ניסוי הכלאה. לדוגמה resuspension של דנ"א טריס - EDTA (TE) במקום מים אינה מומלצת כמו ריכוז מלח גבוה יכולים לעכב את התגובה תיוג. אנו ממליצים assaying איכות דנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop למדוד גם את כמות ה-DNA, כמו גם הצורה הכללית של עקומת ספיגת לבין 260/280, 260/230 יחס.
כביסה: הסרת שקופיות הקלטת הכלאה והעברת לפתרון לשטוף מחומם הוא שלב קריטי בתהליך הכלאה כמו הכלאה פתרון קל DIG מתגבש מהר מאוד. חשוב לשטוף את הפתרונות להיות ב-pH נייטרלי והטמפרטורה של הפתרון לשטוף חשוב חומרא תוך הסרת בדיקה מאוגד. לאחר ייבוש שקופיות חשוב להשאיר אותם בחושך אם לא סריקה מיד, או לאחר סריקה אם אתה רוצה לסרוק מחדש אותם במועד מאוחר יותר.
אוזון: האוזון כבר דאגה ברחבי העולם בעת ביצוע מערך CGH. רמות האוזון מעל 5ppm הוכחו להשפיע לרעה על צבעים Cye. Cye 5 הוא רגיש במיוחד השפלה האוזון. צמצום החשיפה האוזון הוא המפתח למניעת השפלה צבע Cye ואובדן אות לפני ובמהלך הסריקה. סריקה בלילה למשל, כאשר האוזון סביבתי הוא בדרך כלל נמוך יותר, אופציה אחת אפשרית. מתחמים אוזון חינם עבור השקופית אוטומטיות כביסה סריקה שונות שקופיות טיפולים כימיים זמינים מסחרית. צבעים עמידים אוזון Cye יש גם לאחרונה פותחו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מבקשים להודות לחברי הצוות לאם וואן BAC מעבדה מערך במיוחד Miwa סוזוקי בריאן צ'י להכנת מאמר זה. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מן המכונים הקנדי לבריאות מחקר הגנום קנדה / הגנום קולומביה הבריטית, ו-NIH / NIDCR מענק RO1 DE15965-01.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega Corp. | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega Corp. | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen, EMD Millipore | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega Corp. | ||
| YM-30 Column | Reagent | EMD Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche Group | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega Corp. | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays. BMC Genomics. 5, 6 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations. Human Genetics. 120, 795-805 (2007).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. SeeGH -- a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data. BMC Bioinformatics. 5, 13 (2004).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data. BMC Bioinformatics. 9, 243 (2008).
- Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L.
- Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples. Genomics. 85, 790-793 (2005).
