Survivable chirurgie stéréotaxique chez les rongeurs

Summary

La surveillance des niveaux de neurotransmetteurs extracellulaire dans les régions cérébrales distinctes d'animaux se déplaçant librement offre un aperçu sur le lien entre la libération des neurotransmetteurs et des comportements. En microdialyse in vivo couplée à une détection électrochimique fournit anatomiques et une résolution excellentes chimiques et des informations sur la façon dont la neurotransmission basale est altérée par des manipulations pharmacologiques ou physiologiques.

Abstract

La capacité de mesurer extracellulaire niveaux de base de neurotransmetteurs dans le cerveau d'animaux éveillés permet la détermination des effets des différents défis systémiques (pharmacologiques ou physiologiques) dans le SNC. Par exemple, on peut mesurer directement la manière dont les projections de l'animal dopamine du mésencéphale répondre à la dopamine libérant des médicaments comme des stimuli d-amphétamine ou naturels, comme la nourriture. Dans cette vidéo, nous vous montrons comment implanter canules Guide cibler des sites spécifiques du cerveau de rat, comment insérer et implanter une sonde de microdialyse et comment utiliser la chromatographie liquide haute performance couplée à une détection électrochimique (HPLC-EC) pour mesurer les niveaux extracellulaires de neurotransmetteurs oxydables et des métabolites. Local précise l'introduction de la drogue à travers la sonde de microdialyse permet un travail affiné sur la spécificité du site dans le mécanisme un composé s de l'action. Cette technique a anatomiques et une résolution excellentes chimiques, mais seulement une résolution temporelle modestes que des échantillons de microdialyse sont habituellement traitées toutes les 20-30 minutes pour assurer des niveaux de neurotransmetteurs détectable. Complémentaire des outils ex vivo (c'est à dire, trancher et de culture de cellules électrophysiologie) peut aider à la surveillance en temps réel la neurotransmission.

Protocol

Résumé

Deux mois en moyenne l'âge des souris C57BL/6J ou équivalent ou trois mois en moyenne l'âge des rats Sprague-Dawley ou équivalent sont anesthésiés à la kétamine (60 mg / kg ip pour le rat, 100 mg / kg ip chez la souris) et de xylazine (10 mg / kg, ip pour les deux espèces). La sédation est surveillé par un pincement de l'orteil douce retirer réflexes démontré dans Walantus et al. (Jupiter, 6, 2007) et Szot et al. (Jupiter, 9, 2007). Thermorégulation peut être fournie par un coussin chauffant thermostatregulated (ALA Instruments Inc) et surveillé par un thermomètre rectal. Tête est rasée de la fourrure et nettoyé avec de l'iode avant l'incision. Après incision de la peau (2 cm de long pour les rats, 1 cm de long pour les souris) et la suppression de tous les tissus mous de la surface du crâne, le placement de la canule guide est déterminée par rapport au bregma. Un trou de 6 mm est percé dans le crâne avec une perceuse à piles conçu pour la chirurgie des rongeurs (Outils Fine Science, Inc.) Les soins sont prises afin que le foret ne pénètre pas à travers les membranes méningées ou des vaisseaux sanguins. Crâne est implanté avec bilatérale 5 mm 21 inoxydable de calibre arbres de guidage en acier menant à niveau du noyau accumbens postérieure, striatum dorsal ou cortex préfrontal. Les coordonnées stéréotaxiques sont établis selon Franklin et Paxinos, 1997 (le cerveau de souris en coordonnées stéréotaxiques, Academic Press) ou Paxinos et Watson, 2006 (le cerveau du rat dans les coordonnées stéréotaxiques, Academic Press). Les implants sont garantis par un ciment dentaire. Un bolus de Ringer de la solution saline à 0,9% est donnée à la fin de la chirurgie (5mls SC chez le rat et 1 ml SC chez la souris après fluides sont réchauffé à la température normale du corps) pour éviter la déshydratation. La buprénorphine (0.1-0.5mg/kg SC) est administré deux fois par jour et, ensuite, sur une base comme-nécessaire, si l'animal semble être dans la douleur. Traitement antibiotique local (pommade de bacitracine) et un traitement systémique par antibiotiques (pénicilline 100 000 UI / kg IM toutes les 12 heures pendant les 48 premières heures post-opératoires) sont administrés si infections post-opératoires se produisent.

Après la chirurgie, les animaux sont logés individuellement avec de la nourriture et l'eau ad libitum disponibles. Au moins une semaine est autorisé pour la récupération, avant de microdialyse et l'euthanasie. Après récupération de la chirurgie, les animaux sont transférés dans une cage et les sondes de microdialyse microdialyse sont insérés et cimenté dans le puits guide qui ont été installés pendant la chirurgie. Sonde d'insertion ne cause pas de douleur ou d'inconfort, car la sonde est court-circuitant les tissus cutanés, les muscles et méningé travers l'arbre de guidage. Par conséquent, insertion de la sonde se fait sans anesthésie et les effets induits par l'anesthésie sur la neurochimie ou de comportement sont évités. Nous laissons les sondes se stabiliser pendant 12 heures, puis on commence l'échantillonnage toutes les 30 minutes pour un autre 8-12 heures en fonction de l'expérience. Nous surveillons le comportement locomoteur de l'animal grâce à des cellules photoélectriques ou l'enregistrement manuel du mouvement par l'expérimentateur. Échantillons microdialysat sont injectés dans une chromatographie liquide haute performance avec détection électrochimique (HPLC-EC) pour la détection de l'instrument neurochimiques et d'analyse. Nous recherchons des effets sur la neurochimie basale et le comportement locomoteur. A la fin de l'expérience de l'animal est euthanasié par une surdose de kétamine systémique (200 mg / kg ip) et de xylazine (20 mg / kg, ip). Alors le coeur est perfusé avec une solution saline à 0,9% suivie par 4% de paraformaldéhyde. Les cerveaux sont prélevés, congelés et couper le long des voies de sonde de microdialyse pour vérifier le placement de sonde précis.

Procédure

1. Mettre en place l'instrument stéréotaxique et tout le matériel nécessaire. Assurez-vous que la zone et les instruments sont nettoyés et stérilisés.
   
   
2. Raser la fourrure avec un rasoir électrique. Aller de l'oreille à juste-entre les yeux, se déplacer de rasoir dans différentes directions pour nettoyer efficacement domaine de la fourrure. Appliquer povidine / iode zone rasée, mais de protéger les yeux contre elle.
   
   
3. Mont de l'animal sur l'appareil de stéréotaxie en plaçant les barres d'oreille dans le canal auditif et le resserrement en place. Premier montage barre une oreille dans le canal auditif, puis le maintenir en place et faire glisser dans la barre de l'autre oreille. Vous savez que vous êtes au bon endroit quand la tête ne peut plus être déplacé latéralement. Fixez la bouche avec la monture antérieure de la stéréotaxie et assurez-vous que la tête est de niveau avec une règle. Mettez le souverain dans une position verticale par rapport à la plate-forme instrument stéréotaxique et vérifier pour un angle de 90 ° entre le souverain et le milieu du cuir chevelu de l'animal). Confirmez ce à travers l'instrument stéréotaxique si elle offre une telle capacité.
   
   
4. Faire une incision antérieure / postérieure sur le cuir chevelu avec un scalpel stérile s'étend de la lambda à juste entre les yeux de l'animal. Utilisez hémostatiques stérilisés pour pincer la peau et de garder l'incision ouverte. Utilisation de plusieurs tampons de coton stérile, sécher la surface du crâne exposé.
   
   
5. Mettez la canule guider sur sa monture, trouver bregma sur le crâne, et la position de la droite guider la canule plus cet endroit. Notez les coordonnées antérieur / postérieur et latéral. Du bregma, trouver les coordonnées nécessaires pour corriger le placement de votre sonde à l'aide de l'atlas stéréotaxique. Position de la canule guide des coordonnées correctes en ajoutant ou en soustrayant de bregma. Apportez votre canule guider jusqu'à ce qu'il touche le crâne, puis enregistrer cette coordonnée ventrale. Faites une marque au crayon avec un crayon stériles à cet endroit sur le crâne, c'est là que vous serez de forage.
   
   
6. Retirer la canule guide et stériliser votre foret. Soigneusement percer un trou à la marque de crayon jusqu'à ce que vous passer à travers la largeur du crâne. Vérifiez auprès de la canule guide pour voir si elle serait effacer le trou sans toucher les côtés. Gardez le forage et la vérification jusqu'à ce que la canule peut claire dans le droit chemin. Une fois le trou est fait, l'utilisation d'une aiguille stérile pour doucement coup les méninges afin de permettre l'insertion sans obstruction de la canule.
   
   
7. Ensuite, en utilisant une perceuse à main, de faire six trous pour les vis du crâne: deux en avant de l'orifice une canule, deux latéraux du trou canule, et deux postérieures vers les côtés. Stériliser six vis et les placer sur le crâne jusqu'à ce qu'ils soient solidement ancrés sur.
   
   
8. Nettoyer la canule guide avec l'éthanol et la solution saline, monter, et abaissez lentement à la bonne coordination ventrale. Assurez-vous que les côtés ne se touchent pas et qu'il va dans parfaitement vertical.
   
   
9. Placez la vis d'ancrage en dedans et derrière le crâne vis postérieure et le maintenir en place avec des pincettes. Mélanger un lot mince de ciment dentaire liquide et couvrent la canule guide, vis, et le reste du crâne avec une spatule stérile. Faire un autre lot, plus épais cette fois, et couvrir complètement la zone et la vis de la canule et d'ancrage suffisant pour le sécuriser.
   
   
10. Comme le ciment devient plus épaisse et avant qu'il ne se solidifie, séparer la peau de la Coupe du ciment et du moule de la Coupe du ciment avec la spatule pour s'assurer que le bouchon de ciment est lisse tout autour et n'irrite pas la peau plus tard.
    
    
11. Laisser le ciment dentaire sécher complètement avant d'enlever l'animal de l'appareil. Retirez les pinces hémostatiques. Appliquer la bacitracine tout autour du bouchon de ciment.
    
    
12. Une fois l'animal hors de l'instrument stéréotaxique, y injecter 0,25 ml de pénicilline IM (intra-musculaire), suivi par 1 ml de solution saline SC (sous-cutanée).
    
    
13. Placez l'animal dans sa cage et de le surveiller jusqu'à ce qu'elle devienne consciente avant de le retourner à sa salle de récupérer.
    
    
14. Surveiller les animaux jusqu'à ce qu'ils se remettre de l'anesthésie, le jour de la chirurgie et post-op quotidienne, jusqu'à la fin de l'expérience, des signes d'infection et de l'évaluation de la douleur / détresse. Cela inclut les week-ends et jours fériés. Faible mouvement spontané, la vocalisation de détresse lors de la manipulation, une posture voûtée, la diarrhée, de l'enflure et la décharge dans le domaine de l'headmount, et le manque d'alimentation / boisson sont tous des signes de douleur et de détresse. La buprénorphine (0.1-0.5mg/kg SC) est administré deux fois par jour, puis, sur une base comme-nécessaire, si l'animal semble être dans la douleur. Traitement antibiotique local (pommade de bacitracine) et un traitement systémique par antibiotiques (pénicilline 100 000 UI / kg IM toutes les 12 heures pendant les 48 premières heures post-opératoires) sont administrés si infections post-opératoires se produisent. Si aucun de ces symptômes persistent après l'administration de la buprénorphine, le fluide supplémentaire, et un traitement antibiotique dans les 12 heures de la chirurgie, l'animal est euthanasié.

Discussion

En microdialyse in vivo est l'outil de choix pour mesurer les neurotransmetteurs multiples et de ses métabolites dans des sites distincts du cerveau d'un animal vivant. Cependant, il ne contrôle que les niveaux extracellulaires de neurotransmetteurs et il n'offre pas la résolution de temps pour surveiller l'exocytose des neurotransmetteurs en temps réel. Grâce à une version de la technique appelée «net-flux», la concentration des neurotransmetteurs réelles sur un site donné peut être calculé, ce qui peut donner des mesures précises du taux de neurotransmetteurs du recaptage de la grâce des transporteurs membranaires du plasma.

Microdialyse est idéal pour illustrer les différences de niveaux de neurotransmetteurs basale extracellulaire entre les différents groupes d'animaux (à savoir les différents génotypes) et à déchiffrer les effets des médicaments ou autres manipulations sur la libération des neurotransmetteurs.

L'introduction de tests alternatifs à la HPLC-CE comme l'électrophorèse capillaire de zone (CZE) couplée à une détection fluorescente a augmenté le temps de résolution de la microdialyse in vivo en quelques minutes par échantillon.

Materials

Materials are described in the protocol document.