Summary
ניטור של רמות הנוירוטרנסמיטר תאי מוח באזורים שונים של בעלי חיים באופן חופשי לנוע מציע תובנות על הקשר בין שחרור הנוירוטרנסמיטר והתנהגות. בשנת vivo microdialysis יחד עם זיהוי אלקטרוכימי מספק אנטומי מעולה ברזולוציה כימיים ומידע איך עצבית הבסיס משתנה על ידי מניפולציות תרופתי או פיזיולוגי.
Abstract
היכולת למדוד את רמות הבסיס תאיים של נוירוטרנסמיטורים במוח של חיות ער מאפשר לקביעת ההשפעות של אתגרים מערכתיים שונים (תרופתי או פיזיולוגי) של מערכת העצבים המרכזית. לדוגמה, ניתן למדוד ישירות איך הדופמין במוח התיכון של החיה תחזיות להגיב דופמין שחרור תרופות כמו גירויים d-אמפטמין או טבעיים כמו מזון. בסרטון הזה, אנו מראים לך איך שתל cannulas מדריך מיקוד לאתרים ספציפיים במוח חולדה, איך להוסיף שתל בדיקה microdialysis וכיצד להשתמש ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם זיהוי אלקטרוכימי (HPLC-EC) כדי למדוד רמות של תאי נוירוטרנסמיטורים oxidizable ומטבוליטים. מבוא מדויק מקומי של תרופות באמצעות החללית microdialysis מאפשר עבודה מעודן על סגוליות האתר מנגנון של מתחם הפעולה. טכניקה זו אנטומי מעולה ברזולוציה כימיים אבל רק ברזולוציה זמן צנוע כמו דגימות microdialysis מעובדים בדרך כלל כל 20-30 דקות כדי להבטיח רמות הנוירוטרנסמיטר לזיהוי. כלים משלימים לשעבר vivo (כלומר, פרוסה והתרבות תא electrophysiology) יכול לסייע עם ניטור בזמן אמת עצבית.
Protocol
תקציר
שני בן חודש ממוצע C57BL/6J גיל עכברים או שווה ערך או שלושה חודשים הישן הגיל הממוצע חולדות Sprague Dawley או שווה ערך מורדמים עם קטמין (60 מ"ג / ק"ג ה-IP של חולדות: 100 מ"ג / ק"ג ip עבור עכברים) ו xylazine (10 מ"ג / kg, ip גם עבור מינים). הרגעה היא לנטר באמצעות קמצוץ הבוהן עדין לסגת רפלקס הפגינו Walantus et al. (יופיטר, 6, 2007) ו Szot et al. (יופיטר, 9, 2007). Thermoregulation ניתן לספק באמצעות כרית חימום thermostatregulated (ALA מכשירים בע"מ) וכן פיקוח באמצעות מדחום רקטלי. ראש מגולח הוא פרווה וניקה עם יוד לפני החתך. לאחר חיתוך העור (2 ס"מ על חולדות, 1 ס"מ על עכברים) והסרה של כל רקמות רכות מפני השטח של הגולגולת, המיקום של צינורית מדריך נקבעת ביחס גבחת. חור 6 מ"מ הוא קדח דרך הגולגולת עם הקודח המופעל באמצעות סוללה נטענת המיועד לניתוח מכרסם (כלים המדע פיין, Inc). טיפול נלקחת כך המקדח אינו לחדור דרך ממברנות קרום המוח או כלי הדם. גולגולת הוא מושתל עם הבילטרליים 5 21 מ"מ מד נירוסטה פירים המדריך המוביל בגרעין הנסמך האחורי, בסטריאטום הגבי או קליפת המוח הקדם חזיתית. הקואורדינטות stereotaxic נקבעים לפי פרנקלין Paxinos, 1997 (המוח עכבר קואורדינטות Stereotaxic, Academic Press) או Paxinos ווטסון, 2006 (המוח עכברוש בקואורדינטות Stereotaxic, לחץ האקדמית). שתלים מובטחות מלט שיניים. בולוס של האצבעות Lactated של תמיסת מלח 0.9% ניתנת בסוף הניתוח (5mls SC בחולדות 1 מ"ל SC בעכברים לאחר נוזלים הם חיממו את טמפרטורת הגוף הרגילה) כדי למנוע התייבשות. עצירות (0.1-0.5mg/kg SC) ניתנת פעמיים ביום, ולאחר מכן, על בסיס במידת הצורך, אם בעל החיים נראה סובל מכאבים. טיפול אנטיביוטי מקומי (משחת bacitracin) וטיפול אנטיביוטי מערכתית (פניצילין 100,000 IU / kg IM כל 12 שעות במשך 48 השעות הראשונות שלאחר הניתוח) מנוהלים אם שלאחר הניתוח זיהומים להתרחש.
בעקבות הניתוח, בעלי חיים הם שוכנו בנפרד עם מזון זמין כרצונך מים המודעה. לפחות שבוע מותרת להתאוששות לפני microdialysis ו המתת חסד. לאחר התאוששות מניתוח, החיות מועברים לכלוב microdialysis ו בדיקות microdialysis מוכנסים ו ביצרו את פירים מדריך שהותקנו במהלך הניתוח. בדיקה הכניסה אינו גורם כאב או אי נוחות כי החללית היא עקיפת רקמות, עור שרירים קרום המוח דרך הפיר מדריך. לכן, הכניסה בדיקה נעשית ללא הרדמה וכל הרדמה-Induced ההשפעות על התנהגות הנוירוכימיה או נמנעים. אנחנו נותנים בדיקות לייצב במשך 12 שעות ואז אנחנו מתחילים דגימה כל 30 דקות למשך 8-12 שעות, תלוי בניסוי. אנחנו עוקבים אחר התנהגות של תנועה של בעל החיים באמצעות שתאי או הקלטה ידנית של התנועה על ידי הנסיין. דגימות Microdialysate מוזרקים כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים עם זיהוי אלקטרוכימי (HPLC-EC) מכשיר לגילוי ניתוח neurochemical ו. אנחנו מחפשים השפעות על הנוירוכימיה הבסיס והתנהגות של תנועה. בסוף הניסוי בבעלי חיים הוא מורדמים באמצעות מנת יתר של קטאמין מערכתית (200 מ"ג / ק"ג IP) xylazine (20 מ"ג / ק"ג, ip). ואז הלב perfused עם מלח 0.9% ואחריו paraformaldehyde 4%. המוח מוסרים, קפוא לחתוך לאורך דרכי microdialysis בדיקה כדי לוודא מיקום מדויק בדיקה.
נוהל
- הגדר את מכשיר stereotaxic ואת כל החומרים הדרושים. ודא אזור ומכשירים מנקים ו מעוקרים.
- לגלח את הפרווה עם מכונת גילוח חשמלית. עבור מהאוזניים רק ב-בין העיניים, להעביר תער לכיוונים שונים ביעילות לנקות שטח של פרווה. החל povidine / יוד לאזור מגולח אבל להגן על העיניים ממנה.
- הר חיה על המנגנון stereotaxic ידי הצבת הסורגים האוזן לתוך תעלת האוזן והידוק למקומו. ראשית הר חטיף אוזן בתעלת האוזן, ואז להחזיקו במקום והחלק בבר האוזן אחרים. אתה יודע שאתה נמצא במיקום הנכון כאשר הראש כבר לא יכול להיות עבר מצד לצד. אבטח את הפה עם הר הקדמי של stereotaxic ולוודא כי הראש הוא רמה עם סרגל. שים את שליט במצב אנכי לגבי פלטפורמת מכשיר stereotaxic ולבדוק בזווית של 90 מעלות בין השליט לבין האמצעי של הקרקפת של החיה). אישור זה דרך המכשיר stereotaxic אם הוא מציע יכולת כזו.
- בצע חתך קדמית / אחורית על הקרקפת עם אזמל סטרילי המשתרעת למבדה רק ב-בין העיניים של החיה. השתמש hemostats מעוקרים לצבוט את העור, לשמור על החתך פתוח. באמצעות כמה צמר גפן סטרילי, יבש את המשטח גולגולת חשופה.
- מכניסים את הצינורית מדריך על הר שלה, למצוא גבחת על הגולגולת, ואת המיקום הנכון צינורית מדריך על מיקום זה. רשמו את הקואורדינטות קדמית / אחורית וצדדית. מ גבחת, למצוא את הקואורדינטות הנכונות הדרושות המיקום של החללית שלך בעזרת האטלס stereotaxic. מקם את הצינורית מדריך קואורדינטות הנכון ידי הוספה או הפחתה של גבחת. הביאו צינורית המדריך שלך למטה עד שהוא נוגע בגולגולת, ולאחר מכן להקליט את זה לתאם הגחון. הפוך את סימן העיפרון בעיפרון סטרילי במיקום זה על הגולגולת, זה הוא המקום שבו אתה תהיה קידוח.
- הסר את הצינורית מדריך לעקר המקדח שלכם. בזהירות לקדוח חור על סימן העיפרון עד שאתה מקבל דרך רוחב הגולגולת. בדוק עם צינורית מדריך כדי לראות אם זה היה לנקות את החור בלי לגעת בצדדים. שמור קידוח ובדיקת עד צינורית יכול ברורה בנתיב ישר. לאחר חור הוא עשה, להשתמש במחט סטרילית בעדינות האגרוף קרומי המוח כדי לאפשר החדרה של צינורית בלא הפרעה.
- בשלב הבא, בעזרת מקדחה ידנית, להפוך שישה חורים עבור הברגים בגולגולת: שני קדמי אל החור הצינורית, שני לרוחב לחור הצינורית, ושני האחוריים לצדדים. לעקר six ברגים ומניחים אותם על גבי הגולגולת עד שהם מעוגנים היטב על.
- נקו את צינורית מדריך עם אתנול מלוחים, הר, ולהפחית את זה לאט כדי לתאם את הגחון הנכון. ודא כי הצדדים לא נוגעים וכי הוא הולך אנכי לחלוטין.
- הנח את הבורג עוגן מדיאלית מאחורי הברגים הגולגולת האחורי והחזק אותו במקום עם פינצטה. מערבבים אצווה דקה של דבק דנטלי נוזלי לכסות את הצינורית מדריך, ברגים, ואת שאר הגולגולת עם מרית סטרילית. בצע אחר אצווה, עבה הפעם, לכסות לחלוטין את האזור את הבורג ואת הצינורית עוגן מספיק כדי לאבטח אותו.
- כמו מלט הופך עבה לפני שהוא מתקשה, מפרידים את העור מן הכוס מלט עובש כוס מלט עם מרית כדי לוודא את מכסה בטון חלקה מסביב לא לגרות את העור לאחר מכן.
- אפשר מלט שיניים יבש לחלוטין לפני הסרת חיה מן המנגנון. הסר את hemostats. החל bacitracin כל הדרך סביב כובע הבטון.
- לאחר החיה כבוי המכשיר stereotaxic, להזריק אותו עם 0.25 מ"ל של פניצילין IM (תוך שרירי) ואחריו 1 מ"ל של תמיסת מלח SC (תת עורי).
- מניחים את חיה בכלוב משלו לפקח על זה עד שזה הופך להיות מודע לפני החזרתו לחדר שלו להתאושש.
- צג חיות עד שהם להתאושש מן ההרדמה ביום הניתוח מנותחות מדי יום, עד לסוף הניסוי, סימנים של דלקת והערכה של כאב / מצוקה. זה כולל סופי שבוע וחגים. תנועה ספונטנית נמוכה, הניקוד מצוקה על טיפול, יציבה כפופה, שלשולים, נפיחות והפרשות בתחום headmount, ואת חוסר האכלה / שתייה הם כולם סימנים של כאב ומצוקה. עצירות (0.1-0.5mg/kg SC) ניתנת פעמיים ביום, ולאחר מכן, במידת הצורך, אם בעל החיים נראה סובל מכאבים. טיפול אנטיביוטי מקומי (משחת bacitracin) וטיפול אנטיביוטי מערכתית (פניצילין 100,000 IU / kg IM כל 12 שעות במשך 48 השעות הראשונות שלאחר הניתוח) מנוהלים אם שלאחר הניתוח זיהומים להתרחש. אם כל התופעות הללו נמשכות בעקבות ניהול עצירות, נוזל משלימה, וטיפול אנטיביוטי תוך 12 שעות ניתוח, החיה מורדמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשנת vivo microdialysis היא הכלי המועדף למדידת נוירוטרנסמיטרים מרובים מטבוליטים באתרים שונים של המוח החי. עם זאת, רק מפקחת רמות של תאי neurochemicals וזה לא מציעים את הפתרון זמן כדי לפקח exocytosis נוירוטרנסמיטר בזמן אמת. באמצעות גרסה של טכניקה המכונה "נטו השטף", ריכוז הנוירוטרנסמיטר בפועל באתר נתון יכול להיות מחושב, אשר בתורו יכול לתת מדידות מדויקות של קצב ספיגה חוזרת של מוליך עצבי באמצעות מובילי פלזמה הממברנה.
Microdialysis אידיאלי להמחשת ההבדלים הבסיסיים רמות הנוירוטרנסמיטר תאיים בין קבוצות שונות של בעלי חיים (גנוטיפים שונים כלומר) ו בפענוח את ההשפעות של תרופות או מניפולציות אחרות על שחרור הנוירוטרנסמיטר.
המבוא של מבחני חלופה HPLC-EC כמו אלקטרופורזה אזור נימי (CZE) יחד עם זיהוי פלורסנט הגדילה את הרזולוציה של פעם ב microdialysis vivo תוך דקות ספורות לדגימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
נתמך על ידי DK065872 (ENP), קרן משפחת סמית פרס הצטיינות במחקר ביו (ENP), F31 DA023760.
Materials
| Materials are described in the protocol document. |
References
- Bungay, P. M., Newton-Vinson, P., Isele, W., Garris, P. A., Justice, J. B. Microdialysis of dopamine interpreted with quantitative model incorporating probe implantation trauma. J. Neurochem. 86, 932-946 (2003).
- Chen, K. C. Effects of tissue trauma on the characteristics of microdialysis zero-net-flux method sampling neurotransmitters. Journal of Theor. Biology. 238, 863-881 (2006).
- Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
- Pothos, E. N., Creese, I., Hoebel, B. G. Restricted eating with weight loss selectively decreases extracellular dopamine in the nucleus accumbens and alters dopamine response to amphetamine, morphine and food intake. The Journal of Neuroscience. 15, 6640-6650 (1995).
