Summary
Hayvanların serbestçe hareket eden, farklı beyin bölgeleri ekstrasellüler nörotransmitter düzeylerinin izlenmesi nörotransmitter salınımı ve davranış arasındaki bağlantıyı irdeliyoruz. Ve bazal nörotransmisyon farmakolojik veya fizyolojik manipülasyonlar nasıl değiştirdiğini hakkında bilgi; in vivo mikrodiyaliz elektrokimyasal algılama ile birleştiğinde mükemmel anatomik ve kimyasal çözünürlük sağlar.
Abstract
MSS farklı sistemik sorunlar (farmakolojik veya fizyolojik) etkilerinin belirlenmesi için uyanık hayvanların beyin nörotransmitterlerin ekstrasellüler bazal düzeylerini ölçmek için yeteneği sağlar. Örneğin, bir doğrudan hayvanın orta beyin dopamin projeksiyonları d-amfetamin veya doğal yiyecek gibi uyaranlara gibi dopamin serbest ilaçlara cevap nasıl ölçebilirsiniz. Bu video mikrodiyaliz prob eklemek ve implant ve ekstrasellüler düzeylerini ölçmek için elektrokimyasal algılama (HPLC-EC) ile birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi nasıl kullanılacağını nasıl, sıçan beyin belirli siteleri hedef kılavuz kanüller implant nasıl gösterir oksitleyici nörotransmitterlerin ve metabolitleri. Mikrodiyaliz prob aracılığıyla ilaçlar Yerel hassas giriş alana özgü rafine bir iş için bir eylem bileşik s mekanizması sağlar. Bu teknik, mükemmel anatomik ve kimyasal çözümü vardır ama sadece mikrodiyaliz örnekleri gibi mütevazı bir zaman çözünürlük genellikle saptanabilir nörotransmitter düzeylerini sağlamak için her 20-30 dakikada bir işlenir. Tamamlayıcı ex vivo araçları (yani, dilim ve hücre kültürü elektrofizyoloji), gerçek zamanlı nörotransmisyon izleme ile yardımcı olabilir.
Protocol
Özet
Ve xylazine (10 mg; İki aylık ortalama yaş C57BL/6J fareler veya eşdeğer ya da üç aylık eski yaş ortalaması Sprague Dawley rat veya eşdeğeri ketamin (100 mg / kg ip fareler için sıçanlar için 60 mg / kg ip) ile anestezi / kg, türler ya da ip). Sedasyon refleks gösterdiği çekilme yumuşak bir ayak tutam kullanarak izlenir . Walantus ve ark (Jüpiter, 6, 2007) ve Szot ve ark. (Jüpiter, 9, 2007). Termoregülasyon thermostatregulated bir ısıtma yastığı (ALA Instruments Inc.) Aracılığıyla sağlanan ve bir rektal termometre ile takip edilebilir. Baş kürk traş ve kesi önce iyot ile temizlenmelidir. Cilt kesisi (sıçanlar, fareler için 1 cm uzunluğunda 2 cm uzunluğunda) ve tüm yumuşak doku kafatası yüzeyinden kaldırılması sonra, kılavuz kanül yerleştirilmesi bregma ilgili belirlenir. 6 mm delik kemirgen cerrahi için tasarlanmış bir pille çalışan delici (Güzel Bilim Araçlar, Inc.) Kafatası yoluyla delinmiş. Bakım matkap meningeal zarlarına ya da kan damarları aracılığıyla nüfuz etmez, böylece alınır. Kafatası posterior çekirdek accumbens, dorsal striatum veya prefrontal korteks önde gelen ikili 5 mm 21 gauge paslanmaz çelik kılavuz milleri ile yerleştirilir. Franklin ve Paxinos, 1997 başına stereotaksik koordinatları olarak kurulan (Stereotaksik Koordinatlar Fare Beyin, Academic Press) veya Paxinos ve Watson, 2006 (Academic Press Stereotaksik Koordinatlar, Rat Beyin). İmplantlar, diş çimento tarafından teminat altına alınmıştır. % 0.9 serum fizyolojik bolus Laktatlı Zil sesleri, su kaybını önlemek için cerrahi sonunda (sıçanlarda 5mls SC ve fareler üzerinde yapılan 1 ml SC sıvılar normal vücut ısısı kaynaştı sonra) verilir. Buprenorfin (0.1-0.5mg/kg SC), hayvan acı görünür bir şekilde ihtiyaç duyulan bazında, daha sonra, günde iki kez uygulanan ve. Post-operatif enfeksiyon oluşursa Yerel antibiyotik tedavisi (basitrasin merhem) ve sistemik antibiyotik tedavisi (penisilin 100.000 IU / kg), ilk 48 saat post-op için her 12 saatte bir IM yönetilmektedir.
Ameliyatın ardından, hayvanlar tek tek yiyecek ve su ad libitum yerleştirilmiştir. En az bir hafta önce kurtarma mikrodiyaliz ve ötenazi için izin verilir. Cerrahi kurtarma ardından, hayvanlar, bir mikrodiyaliz kafes ve mikrodiyaliz sondalar, ameliyat sırasında kurulmuş kılavuz milleri takılı ve çimentolu aktarılır. Prob kılavuz mili ile, deri, kas ve meningeal doku atlayarak çünkü prob yerleştirilmesi ağrı veya rahatsızlık neden olmaz. Bu nedenle, prob yerleştirilmesi anestezi olmadan yapılır ve nörokimyasal veya davranışı üzerinde herhangi bir anestezi kaynaklı etkiler kaçınılır. Biz deney bağlı olarak başka bir 8-12 saat boyunca her 30 dakikada bir örnekleme probları 12 saat stabilize izin ve. Biz lokomotor fotoseller veya deneyci tarafından hareketinin manuel kayıt yoluyla hayvan davranışlarını izlemek. Microdialysate örnekleri Elektrokimyasal Algılama (HPLC-EC) nörokimyasal algılama ve analiz aracı ile Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi içine enjekte edilir. Bazal nörokimyasal ve lokomotor davranışları üzerindeki etkileri için bekliyoruz. Deneyin sonunda hayvanın aşırı dozda sistemik ketamin (200 mg / kg ip) ve xylazine (20 mg / kg, ip) tarafından ötenazi. Daha sonra kalp,% 4 paraformaldehid tarafından takip% 0.9 serum fizyolojik ile perfüze. Beyinleri, dondurulmuş ve doğru prob yerleşimi doğrulamak için mikrodiyaliz prob yolu boyunca kesilir.
Prosedür
- Stereotaksik alet ve gerekli tüm malzemeleri ayarlayın. Alan ve araçların temizlenmesi ve sterilize emin olun.
- Elektrikli tıraş makinesi ile kürk traş ediyorum. Kulakları, gözleri arasında git, kürk alanı etkin bir şekilde temizlemek için farklı yönlere jilet hareket. Povidin / iyot traş alana uygulayın ama o gözleri korumak.
- Hayvan, kulak kanalı içine yerleştirerek ve kulak çubukları yerleştirin sıkma stereotaksik aparat üzerine monte edin. İlk montaj bir kulakta kulak kanalına bar ve yeri ve diğer kulak çubuğu slayt tutun. Kafası artık yan yana hareket ettirilebilir zaman doğru yerde biliyoruz. Stereotaksik ön montaj ile ağız Güvenli ve kafası bir cetvel ile aynı seviyede olduğundan emin olun. Dikey konumda stereotaksik araç platformu ile ilgili bir cetvel yerleştirin ve hayvan kafa derisi cetvel ve orta arasında 90 ° açı). Bu yeteneği sunar stereotaksik aracı ile bunu doğrulamaktadır.
- Lambda sadece hayvanın gözleri arasında uzanan bir steril neşter ile kafa derisi üzerinde bir ön / arka kesi olun. Sterilize hemostat cilt çimdik ve kesi açık tutmak için kullanın. Birkaç steril pamuklu çubuk kullanarak, açıkta kalan kafatası yüzeyi kurulayın.
- Bu konumu üzerinden kılavuz kanül sağ bregma, kafatası ve pozisyon bulmak, montaj üzerine kılavuz kanül koyun. Anterior / posterior ve lateral koordinatlarda yazınız. Bregma, stereotaksik atlas yardımı ile prob yerleştirilmesi için gerekli olan doğru koordinatları bulabilirsiniz. Bregma gelen ekleyerek veya çıkarılarak doğru koordinatları kılavuz kanül yerleştirin. Sonra bu ventral koordinat kayıt kafatası dokunmadan, kadar kılavuz kanül getirin. Kafatası bu yerde steril bir kalem ile bir kalem işareti olun, bu size sondaj olacak.
- Kılavuz kanül çıkarın ve matkap sterilize edin. Kafatası genişliği üzerinden elde edene kadar dikkatlice kalem işareti de bir delik açın. Kılavuz kanül ile yanlarda dokunmadan delik açık olup olmadığını görmek için kontrol edin. Kanül düz bir yol temizlemek kadar delme ve kontrol edin. Delik yapıldıktan sonra, yavaşça kanül engelsiz ekleme sağlamak amacıyla meninksler yumruk steril bir iğne kullanın.
- Kanül delik ve arka iki taraf için lateral kanül delik, iki iki anterior: Sonra, bir yandan matkap kullanarak, kafatası vidalar için altı delik. Altı vida sterilize ve sıkıca demirlemiş kadar kafatası üzerine koyun.
- Etanol ve serum fizyolojik, montaj kılavuzu kanül temizleyin ve uygun ventral koordine etmek için yavaş yavaş daha düşük. Taraf dokunmadan değildir ve mükemmel bir şekilde dikey olduğunu emin olun.
- Medial ve posterior kafatası vida arkasında çapa vida yerleştirin ve cımbız ile bir yerde tutun. Ince bir parti sıvı diş çimento karıştırın ve kılavuz kanül, vidalar, kafatası ve steril bir spatula ile geri kalanını kapsayacak. Başka bir parti, daha kalın bu kez, tamamen alan ve onu korumak için yeterli kanül ve çapa vida kapağı olun.
- Çimento kalın olur ve katılaşır önce çimento kapağını pürüzsüz ve daha sonra cildi tahriş etmez emin olmak için spatula ile çimento fincan çimento fincan cilt ayrı ve kalıp.
- Diş çimento, hayvan cihazdan çıkarmadan önce tamamen kurumasını bekleyin. Hemostat çıkarın. Basitrasin çimento kap etrafında her şekilde uygulayın.
- Sonra hayvan stereotaksik cihaz kapalı, 1 ml serum fizyolojik SC (subkutan) tarafından takip penisilin IM (kas-içi) 0.25 ml enjekte edilir.
- Hayvan kendi kafesine yerleştirin ve onu kurtarmak için onun odasına dönmeden önce bilinçli hale gelinceye kadar izlemek.
- Onlar, cerrahi ve günlük post-op gün anestezi kurtarmak kadar enfeksiyon ve ağrı / sıkıntı değerlendirilmesi belirtileri, deney sonuna kadar, hayvanlar Monitör. Bu hafta sonları ve tatil günleri içerir. Düşük spontan hareket, taşıma üzerine sıkıntı seslendirme, hunched duruş, ishal, şişkinlik ve headmount alan ve beslenme eksikliği / içme akıntı, ağrı ve sıkıntı tüm işaretler vardır. Buprenorfin (0.1-0.5mg/kg SC) hayvan acı görünmesi durumunda, ihtiyaç duyulan bir bazında, daha sonra günde iki kez uygulandı. Post-operatif enfeksiyon oluşursa Yerel antibiyotik tedavisi (basitrasin merhem) ve sistemik antibiyotik tedavisi (penisilin 100.000 IU / kg), ilk 48 saat post-op için her 12 saatte bir IM yönetilmektedir. Bu belirtilerden herhangi biri buprenorfin yönetimi, ek sıvı ve ameliyattan 12 saat içinde antibiyotik tedavisi sonrasında devam ederse, hayvan ötenazi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo mikrodiyaliz yaşayan bir hayvanın farklı beyin sitelerinde birden fazla nörotransmitter ve metabolitleri ölçmek için tercih edilen bir araçtır. Ancak, sadece ekstraselüler nörokimyasalların seviyeleri izler ve gerçek zamanlı olarak nörotransmitter ekzositoz izlemek için zaman çözünürlüğü sunmuyor. "Net akı" olarak adlandırılan tekniği bir sürümü sayesinde, belirli bir yerinde gerçek bir nörotransmitter konsantrasyonu, plazma zarı taşıyıcıları da ile geri alım, nörotransmitter oranı doğru ölçümler verebilir, hesaplanan olabilir.
Mikrodiyaliz hayvanların farklı gruplar arasında (yani farklı genotipleri) ve nörotransmitter salınımı üzerine etkileri uyuşturucu ya da diğer manipülasyonlar deşifre bazal ekstrasellüler nörotransmitter düzeylerinde farklılıklar gösteren idealdir.
HPLC-EC floresan algılama ile birleştiğinde kapiler zon elektroforezi (ÇEK) gibi alternatif testlerin tanıtımı, örnek başına birkaç dakika içinde İn Vivo Mikrodiyaliz zaman çözünürlüğü artmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
DK065872 (AKP), Biyomedikal Araştırma Mükemmellik Smith Aile Vakfı Ödülü (AKP), F31 DA023760 tarafından desteklenir.
Materials
| Materials are described in the protocol document. |
References
- Bungay, P. M., Newton-Vinson, P., Isele, W., Garris, P. A., Justice, J. B. Microdialysis of dopamine interpreted with quantitative model incorporating probe implantation trauma. J. Neurochem. 86, 932-946 (2003).
- Chen, K. C. Effects of tissue trauma on the characteristics of microdialysis zero-net-flux method sampling neurotransmitters. Journal of Theor. Biology. 238, 863-881 (2006).
- Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
- Pothos, E. N., Creese, I., Hoebel, B. G. Restricted eating with weight loss selectively decreases extracellular dopamine in the nucleus accumbens and alters dopamine response to amphetamine, morphine and food intake. The Journal of Neuroscience. 15, 6640-6650 (1995).
