Summary
رصد مستويات الناقلات العصبية في المخ في مناطق خارج الخلية متميزة من التحرك بحرية حيوانات يقدم رؤى حول الربط بين الافراج عن العصبي والسلوك. في الجسم الحي microdialysis مقرونا الكشف الكهروكيميائية التشريحية ممتازة ويوفر القرار الكيميائية ، ومعلومات عن كيفية تغيير العصبي القاعدية بواسطة التلاعب الدوائية أو الفسيولوجية.
Protocol
ملخص
شهرين من العمر متوسط عمر الفئران C57BL/6J أو ما يعادلها أو ثلاثة أشهر متوسط عمر الفئران سبراغ داولي القديمة أو ما يعادلها يتم تخدير مع الكيتامين (60 ملغم / كغم من الملكية الفكرية بالنسبة للفئران ، و 100 ملغم / كغم من الملكية الفكرية بالنسبة للفئران) وزيلازين (10 ملغ / كغ ، والملكية الفكرية إما الأنواع). ويتم رصد التخدير باستخدام إصبع قرصة طيف سحب منعكس تظاهروا في Walantus وآخرون (إن الرب ، 6 ، 2007) و Szot وآخرون (إن الرب ، 9 ، 2007). ويمكن توفير الحراري من خلال لوحة التدفئة thermostatregulated (ALA آلات شركة) ورصدها من خلال ميزان حرارة المستقيم. غير حليق الرأس من الفراء وتنظيفها مع اليود قبل شق. بعد شق الجلد (2 سم الفئران لفترة طويلة ، طويلة ل1 سم الفئران) وإزالة جميع الأنسجة اللينة من سطح الجمجمة ، يتم تحديد موضع قنية دليل في ما يتعلق bregma. ومن حفر حفرة 6 ملم من خلال الجمجمة مع الحفار يعمل بواسطة بطارية مصممة لإجراء عملية جراحية القوارض (أدوات العلوم الجميلة ، وشركة). هو الحرص بحيث لا مثقاب اختراق من خلال الأغشية السحائية أو الأوعية الدموية. هو مزروع في الجمجمة مع الثنائي قياس 5 ملم 21 مهاوي غير القابل للصدأ دليل الصلب مما أدى إلى النواة المتكئة الخلفي ، المخطط الظهرية أو قشرة الفص الجبهي. يتم تأسيس إحداثيات التجسيمي حسب فرانكلين وPaxinos ، 1997 (مخ الفأر في الإحداثيات التجسيمي ، الأكاديمي الصحافة) أو Paxinos واتسون ، 2006 (الدماغ الجرذ في الإحداثيات التجسيمي ، الصحافة الأكاديمية) يتم تأمينها عن طريق زرع الأسنان الاسمنت. ويرد بلعة من قارعو الأجراس Lactated المالحة من 0.9 ٪ في نهاية عملية جراحية (SC 5mls في الفئران و1 مل SC في الفئران بعد أن يتم تسخين السوائل لدرجة حرارة الجسم العادية) لمنع الجفاف. يدار البوبرينورفين (0.1-0.5mg/kg SC) مرتين يوميا ، ثم بعد ذلك على أساس ما هو مطلوب ، إذا يبدو أن الحيوانات في الألم. العلاج بالمضادات الحيوية المحلي (باسيتراسين مرهم) ، والعلاج بالمضادات الحيوية الجهازية (البنسلين 100000 وحدة دولية / كغ IM كل 12 ساعة لمدة ال 48 ساعة الأولى بعد العملية) تدار إذا ما بعد الجراحة العدوى تحدث.
بعد الجراحة ، ويعيش بمفرده مع المواد الغذائية والحيوانات المائية بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية المتاحة. يسمح مدة اسبوع على الاقل للتعافي قبل microdialysis والقتل الرحيم. بعد الشفاء من الجراحة ، ويتم نقل الحيوانات الى قفص microdialysis وتحقيقات microdialysis تندس ورسخ في مهاوي الدليل التي تم تثبيتها أثناء الجراحة. المسبار الإدراج لا تسبب الألم أو الانزعاج لأن التحقيق هو تجاوز الجلد والعضلات والأنسجة السحائي خلال رمح الدليل. لذلك ، يتم التحقيق الإدراج دون تخدير وتجنب أي آثار الناجمة عن التخدير في الكيمياء العصبية أو السلوك. تركنا تحقيقات استقرار لمدة 12 ساعة ثم نبدأ أخذ العينات كل 30 دقيقة لمدة 8-12 ساعة اعتمادا على التجربة. نحن نراقب السلوك الحركي للحيوان عن طريق الخلايا الضوئية أو التسجيل اليدوي للحركة من قبل المجرب. يتم حقن عينات Microdialysate في الأداء اللوني السائل عالي مع الكشف الكهروكيميائية (HPLC - EC) أداة للكشف الكيميائية العصبية وتحليلها. نحن نبحث عن الآثار على الكيمياء العصبية القاعدية ، والسلوك الحركي. في نهاية التجربة هو الموت الرحيم للحيوان عن طريق جرعة زائدة من الكيتامين النظامية (200 ملغم / كغم IP) وزيلازين (20 ملغم / كغم ، والملكية الفكرية). ثم perfused القلب مع المالحة 0.9 ٪ تليها بارافورمالدهيد 4 ٪. تتم إزالة العقول ، والمجمدة وقطع على طول المسالك microdialysis التحقيق للتحقق من دقة موضع التحقيق.
إجراء
- إعداد صك التجسيمي وجميع المواد اللازمة. تأكد من تنظيف المنطقة والأدوات وتعقيمها.
- يحلق الفراء مع الحلاقة الكهربائية. الانتقال من الأذنين للتو في الفترات الفاصلة بين العينين ، ونقل الشائكة في اتجاهات مختلفة على نحو فعال لتنظيف المنطقة من الفراء. تطبيق povidine / اليود الى منطقة حلق ولكن حماية العينين من ذلك.
- جبل الحيوان على جهاز التجسيمي بوضع قضبان الأذن في قناة الأذن وتشديد في مكانها. أول جبل الأذن شريط واحد في قناة الأذن ، ومن ثم الاحتفاظ بها في مكان والشرائح في شريط الأذن الأخرى. كنت تعرف انك في الموقع الصحيح عندما لم يعد يمكن أن يتم نقل رئيس الجانب إلى الجانب. تأمين الفم مع جبل الأمامي من التجسيمي وتأكد من أن الرأس هو المستوى مع مسطرة. وضع الحاكم في الوضع العمودي مع احترام إلى منصة التجسيمي الصك والتحقق من زاوية 90 درجة بين الحاكم والمتوسطة في فروة الرأس من الحيوان). تأكيد ذلك من خلال صك التجسيمي اذا كانت تتيح هذه القدرة.
- إجراء شق الأمامي / الخلفي على فروة الرأس مع مشرط معقم تمتد من لامدا فقط في الفترات الفاصلة بين أعين الحيوانات. استخدام المرقأة تعقيمها لقرصة قبالة الجلد والحفاظ على شق مفتوحة. باستخدام عدة مسحات القطن المعقم ، قبالة الجافة على سطح الجمجمة المكشوفة.
- وضع قنية دليل على جبل وأن تجد bregma على الجمجمة ، وموقف الحق قنية دليل على هذا الموقع. كتابة إحداثيات الأمامي / الخلفي والجانبي. من bregma ، العثور على الإحداثيات الصحيحة اللازمة لوضع التحقيق الخاص بمساعدة من الأطلس التجسيمي. موقف قنية دليل لإحداثيات الصحيح من خلال إضافة أو طرح من bregma. جلب قنية الخاص دليل أسفل حتى يتم لمس الجمجمة ، ثم سجل هذا التنسيق البطني. جعل علامة قلم رصاص مع عقيمة في هذا الموقع على الجمجمة ، وهذا هو المكان الذي سيتم الحفر.
- إزالة دليل قنية وتعقيم بت الخاص الحفر. حفر حفرة في بعناية العلامة قلم حتى تحصل من خلال عرض الجمجمة. تحقق مع قنية دليل لمعرفة ما اذا كان واضحا في حفرة دون لمس الجانبين. تبقي الحفر والتدقيق حتى يمكن للقنية واضحة في مسار مستقيم. مرة واحدة يتم إجراء ثقب ، واستخدام إبرة معقمة لكمة بلطف السحايا من أجل السماح الإدراج دون عائق للقنية.
- المقبل ، وذلك باستخدام الحفر ناحية ، وجعل ستة ثقوب للمسامير الجمجمة : اثنان الأمامي لثقب قنية ، واثنين من الأفقي إلى ثقب قنية ، واثنان من الخلف على الجانبين. تعقيم six مسامير ووضعها على الجمجمة حتى يتم بإحكام ترسو عليه.
- تنظيف قنية وإصلاحها مع الايثانول والمياه المالحة ، وجبل ، وانخفاض ببطء لتنسيق بطني المناسبة. تأكد من أن الجانبين لم يتم لمس وأنها تسير في رأسي تماما.
- وضع المسمار مرساة إعلامي ومسامير وراء الجمجمة الخلفية والاحتفاظ بها في مكان مع ملاقط. مزيج دفعة رقيقة من الاسمنت السائل الأسنان وتغطية قنية وإصلاحها ، ومسامير ، والباقي من الجمجمة مع ملعقة العقيمة. جعل دفعة أخرى ، هذه المرة أكثر سمكا ، وتغطي كامل المنطقة وقنية والمسمار مرساة كافية لتأمين ذلك.
- كما يصبح أكثر سمكا الاسمنت وقبل أن يتصلب ، فصل الجلد من الكأس الاسمنت والاسمنت العفن الكأس مع ملعقة للتأكد من أن غطاء الاسمنت على نحو سلس في جميع أنحاء ولا تهيج في الجلد في وقت لاحق.
- السماح للاسمنت الأسنان حتى يجف تماما قبل إزالة الحيوان من الجهاز. إزالة المرقأة. تطبيق باسيتراسين على طول الطريق حول سقف الاسمنت.
- مرة واحدة هذا الحيوان هو خارج الصك التجسيمي ، وضخ مع 0.25 مل من البنسلين IM (داخل العضلات) ، يليه SC 1 مل من المياه المالحة (تحت الجلد).
- وضع في قفص الحيوانات الخاصة بها ومراقبة ذلك حتى يصبح واعيا قبل اعادته الى غرفة لاسترداد.
- رصد الحيوانات حتى يشفى من التخدير في يوم من الجراحة وبعد العملية اليومية ، وحتى نهاية التجربة ، لعلامات العدوى وتقييم الألم / استغاثة. وهذا يشمل عطلة نهاية الأسبوع والأعياد. حركة عفوية منخفضة ، والنطق عند الشدة المناولة والتقوس في الجلوس ، والإسهال ، وتورم والتفريغ في منطقة headmount ، ونقص التغذية / الشرب كلها علامات الألم والضيق. البوبرينورفين (0.1-0.5mg/kg SC) يدار مرتين يوميا ، ثم ، وعلى أساس ما هو مطلوب ، إذا كان الحيوان يبدو أن في الألم. العلاج بالمضادات الحيوية المحلي (باسيتراسين مرهم) ، والعلاج بالمضادات الحيوية الجهازية (البنسلين 100000 وحدة دولية / كغ IM كل 12 ساعة لمدة ال 48 ساعة الأولى بعد العملية) تدار إذا ما بعد الجراحة العدوى تحدث. إذا كان أي من هذه الأعراض التالية تستمر إدارة البوبرينورفين ، السائل الإضافي ، والعلاج بالمضادات الحيوية في غضون 12 ساعة من الجراحة ، والموت الرحيم للحيوان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
microdialysis في الجسم الحي هو الأداة المفضلة لقياس العصبية والأيضات متعددة في مواقع مختلفة من الدماغ حيوان حي. ومع ذلك ، فإنه يرصد فقط مستويات من خارج الخلية neurochemicals وأنها لا توفر الوقت لرصد قرار إيماس العصبي في الوقت الحقيقي. من خلال إصدار من تقنية تسمى "صافي تدفق" ، يمكن حساب تركيز العصبي الفعلية في موقع معين ، والتي بدورها يمكن أن تعطي قياسات دقيقة لمعدل امتصاص الناقل العصبي من خلال نقل غشاء البلازما.
Microdialysis مثالية في توضيح الفروق في المستويات القاعدية خارج الخلية العصبي بين مجموعات مختلفة من الحيوانات (أي المورثات مختلفة) في فك رموز وآثار المخدرات أو معالجات أخرى على الافراج عن العصبي.
وزاد الأخذ المقايسات بديلة لمثل HPLC - EC الكهربائي منطقة الشعرية (تشيكيا) مقرونا الكشف الفلوري القرار في وقت microdialysis المجراة في غضون دقائق قليلة في العينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
بدعم من DK065872 (ENP) ، ومؤسسة عائلة سميث جائزة التميز في البحوث الطبية الحيوية (ENP) ، F31 DA023760.
Materials
| Materials are described in the protocol document. |
References
- Bungay, P. M., Newton-Vinson, P., Isele, W., Garris, P. A., Justice, J. B. Microdialysis of dopamine interpreted with quantitative model incorporating probe implantation trauma. J. Neurochem. 86, 932-946 (2003).
- Chen, K. C. Effects of tissue trauma on the characteristics of microdialysis zero-net-flux method sampling neurotransmitters. Journal of Theor. Biology. 238, 863-881 (2006).
- Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
- Pothos, E. N., Creese, I., Hoebel, B. G. Restricted eating with weight loss selectively decreases extracellular dopamine in the nucleus accumbens and alters dopamine response to amphetamine, morphine and food intake. The Journal of Neuroscience. 15, 6640-6650 (1995).
