Summary
आज़ादी से पशुओं को ले जाने के अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में कोशिकी neurotransmitter स्तरों की निगरानी neurotransmitter रिहाई और व्यवहार के बीच लिंक पर अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. और कैसे बेसल neurotransmission औषधीय या शारीरिक जोड़तोड़ द्वारा बदल दिया है पर जानकारी, vivo में विद्युत का पता लगाने के साथ मिलकर microdialysis में उत्कृष्ट शारीरिक और रासायनिक संकल्प प्रदान करता है.
Abstract
जाग पशुओं के मस्तिष्क में न्यूरोट्रांसमीटर की कोशिकी बेसल के स्तर को मापने की क्षमता सीएनएस विभिन्न प्रणालीगत चुनौतियों औषधीय (या शारीरिक) के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, एक सीधे उपाय कैसे जानवर midbrain dopamine अनुमानों भोजन की तरह घ एम्फ़ैटेमिन या प्राकृतिक उत्तेजनाओं की तरह dopamine जारी दवाओं के जवाब कर सकते हैं. इस वीडियो में, हम आपको बताते हैं कि कैसे गाइड चूहे के मस्तिष्क में विशिष्ट साइटों को लक्षित cannulas प्रत्यारोपण करने के लिए, एक microdialysis जांच कैसे डालने और प्रत्यारोपण करने के लिए और कैसे करने के लिए बाह्य स्तर को मापने का उपयोग करने के लिए उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी विद्युत का पता लगाने (HPLC ईसी) के साथ मिलकर oxidizable न्यूरोट्रांसमीटर और चयापचयों. Microdialysis जांच के माध्यम से स्थानीय दवाओं की सटीक परिचय कार्रवाई का एक यौगिक तंत्र में विशिष्टता साइट पर परिष्कृत काम करने के लिए अनुमति देता है. इस तकनीक उत्कृष्ट शारीरिक और रासायनिक संकल्प है, लेकिन केवल microdialysis नमूने के रूप में मामूली समय संकल्प आमतौर पर हर 20-30 मिनट में संसाधित कर रहे हैं detectable neurotransmitter स्तरों सुनिश्चित है. पूरक पूर्व vivo उपकरण (यानी, टुकड़ा, और सेल संस्कृति इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी) वास्तविक समय neurotransmission निगरानी के साथ सहायता कर सकते हैं.
Protocol
सारांश
और xylazine (10 मिलीग्राम, दो महीने पुराना औसत उम्र C57BL/6J चूहों या समकक्ष या तीन महीने पुरानी औसत उम्र Sprague Dawley चूहों या समकक्ष (चूहों के लिए 100 मिलीग्राम / किग्रा आईपी चूहों के लिए 60 मिलीग्राम / किग्रा आईपी) ketamine के साथ anesthetized हैं / किलो, या तो प्रजातियों के लिए आईपी). बेहोश करने की क्रिया का उपयोग कर एक कोमल पैर के अंगूठे चुटकी वापस लेने पलटा में प्रदर्शन पर नजर रखी है Walantus एट अल. (जौव, 6, 2007) और Szot एट अल. (जौव, 9, 2007). तापमान एक thermostatregulated हीटिंग पैड (ALA इंस्ट्रूमेंट्स इंक) के माध्यम से उपलब्ध कराया जा सकता है और एक गुदा थर्मामीटर के माध्यम से निगरानी. सिर फर के बाल काटे है और चीरा पहले आयोडीन के साथ साफ. त्वचा चीरा (2 सेमी लंबे समय से चूहों, 1 सेमी चूहों के लिए लंबे समय के लिए) और सभी मुलायम ऊतकों की खोपड़ी की सतह से हटाने के बाद, पुस्तिका प्रवेशनी की नियुक्ति bregma के संबंध में निर्धारित किया जाता है. एक 6 मिमी छेद खोपड़ी के माध्यम से एक बैटरी चालित कृंतक सर्जरी के लिए तैयार बरमे वाला (ललित विज्ञान उपकरण इंक) के साथ drilled है. ध्यान रखा जाता है ताकि ड्रिल बिट meningeal झिल्ली या रक्त वाहिकाओं के माध्यम से घुसना नहीं करता है. खोपड़ी द्विपक्षीय 5 मिमी 21 गेज स्टेनलेस स्टील गाइड पीछे नाभिक accumbens, पृष्ठीय striatum या prefrontal प्रांतस्था करने के लिए अग्रणी शाफ्ट के साथ प्रत्यारोपित किया जाता है. stereotaxic निर्देशांक फ्रेंकलिन और Paxinos, 1997 के अनुसार (Stereotaxic ध्रुवीय निर्देशांक में माउस ब्रेन, शैक्षणिक प्रेस) के रूप में स्थापित कर रहे हैं या Paxinos और वाटसन, 2006 (Stereotaxic ध्रुवीय निर्देशांक, शैक्षणिक प्रेस में चूहा मस्तिष्क). समाविष्ट दंत सीमेंट द्वारा सुरक्षित हैं. 0.9% खारा के lactated Ringers का एक सांस में सर्जरी के अंत (चूहों में 5mls अनुसूचित जाति और चूहों में 1 मिलीलीटर अनुसूचित जाति के बाद तरल पदार्थ सामान्य शरीर के तापमान को गर्म कर रहे हैं) के लिए निर्जलीकरण को रोकने के पर दिया जाता है. Buprenorphine (0.1-0.5mg/kg अनुसूचित जाति) दो बार दैनिक प्रशासित किया जाता है और फिर, एक आधार के रूप में की जरूरत पर, अगर जानवर दर्द में प्रतीत होता है. स्थानीय एंटीबायोटिक उपचार (bacitracin मरहम) और प्रणालीगत एंटीबायोटिक उपचार (पेनिसिलिन 100,000 / हर 12 घंटे पहले 48 घंटे के बाद सेशन के लिए आईएम आइयू किलो) अगर पोस्ट ऑपरेटिव संक्रमण होते हैं प्रशासित रहे हैं.
सर्जरी के बाद, जानवरों व्यक्तिगत रूप से भोजन और पानी उपलब्ध विज्ञापन libitum के साथ रखे जाते हैं. कम - से - कम एक सप्ताह microdialysis और इच्छामृत्यु से पहले वसूली के लिए अनुमति दी है. सर्जरी से वसूली के बाद, पशुओं के एक microdialysis पिंजरे और microdialysis डाला और गाइड शाफ्ट है कि सर्जरी के दौरान स्थापित किया गया है में पुख्ता जांच करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. जांच प्रविष्टि दर्द या बेचैनी का कारण नहीं है क्योंकि जांच पुस्तिका शाफ्ट के माध्यम से त्वचा, मांसपेशियों, और meningeal ऊतक को दरकिनार करता है. इसलिए, जांच सम्मिलन संज्ञाहरण के बिना किया जाता है और neurochemistry या व्यवहार पर कोई संज्ञाहरण प्रेरित प्रभाव से परहेज कर रहे हैं. हम जांच 12 घंटे के लिए स्थिर और फिर हम एक और 8-12 घंटे के आधार पर प्रयोग के लिए हर 30 मिनट नमूना शुरू. हम photocells या experimenter द्वारा आंदोलन के मैनुअल रिकॉर्डिंग के माध्यम से पशु की हरकत व्यवहार की निगरानी. Microdialysate नमूने विद्युत (HPLC ईसी) डिटेक्शन neurochemical का पता लगाने और विश्लेषण के लिए साधन के साथ एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी में इंजेक्ट कर रहे हैं. हम बेसल neurochemistry और हरकत व्यवहार पर प्रभाव के लिए देखो. प्रयोग के अंत में पशु प्रणालीगत (200 आईपी मिलीग्राम / किग्रा) ketamine और xylazine (20 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) के एक ज्यादा से euthanized है. तो दिल 0.9% 4% paraformaldehyde के बाद नमक के साथ perfused है. दिमाग निकाल रहे हैं, स्थिर और microdialysis जांच सटीक जांच नियुक्ति की पुष्टि के पथ साथ कटौती.
प्रक्रिया
- Stereotaxic साधन और सभी आवश्यक सामग्री का सेट. यकीन है कि क्षेत्र और उपकरणों को साफ कर रहे हैं और निष्फल.
- बिजली के रेजर के साथ बंद फर दाढ़ी. कान से आँखों में बस के बीच जाओ, अलग अलग दिशाओं में उस्तरा स्थानांतरित करने के लिए प्रभावी ढंग से फर के क्षेत्र को साफ. मुंडा क्षेत्र povidine / आयोडीन लागू लेकिन इसे से आंखों की रक्षा.
- Stereotaxic तंत्र पर कान नहर में कान सलाखों रखने और जगह में कस पशु माउंट. पहले माउंट कान नहर में एक कान बार, और फिर यह जगह में स्लाइड और दूसरे कान पट्टी में पकड़. तुम्हें पता है कि आप सही स्थान में हैं जब सिर नहीं रह पक्ष की ओर ले जाया जा सकता है. Stereotaxic के पूर्वकाल माउंट के साथ मुंह सुरक्षित और सुनिश्चित करें कि सिर एक शासक के साथ स्तर है. Stereotaxic साधन मंच के लिए सम्मान के साथ एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में शासक रखो और मध्यम और जानवर खोपड़ी के शासक के बीच 90 डिग्री कोण की जांच करने के लिए). Stereotaxic साधन के माध्यम से इस पुष्टि करें अगर यह इस तरह की क्षमता प्रदान करता है.
- एक बाँझ लैम्ब्डा से सिर्फ पशु की आंखों के बीच विस्तार स्केलपेल के साथ सिर पर एक पूर्वकाल / पीछे चीरा बनाओ. निष्फल hemostats प्रयोग के लिए रवाना त्वचा चुटकी और चीरा खुला रखने. कई बाँझ कपास swabs का प्रयोग, बंद उजागर खोपड़ी की सतह शुष्क.
- अपने माउंट पर गाइड प्रवेशनी रखो, खोपड़ी पर bregma, और स्थिति को खोजने के इस स्थान पर गाइड प्रवेशनी सही. नीचे / पूर्वकाल पीछे और पार्श्व निर्देशांक लिखो. Bregma से, सही stereotaxic एटलस की सहायता के साथ अपनी जांच के स्थान के लिए आवश्यक निर्देशांक लगता है. जोड़ने या bregma से घटाकर गाइड सही निर्देशांक प्रवेशनी स्थिति. अपने गाइड प्रवेशनी लाओ नीचे जब तक यह खोपड़ी को छू रहा है, और तब इस उदर समन्वय रिकॉर्ड. खोपड़ी पर इस स्थान पर एक बाँझ पेंसिल के साथ एक पेंसिल चिह्न बनाओ, यह है जहाँ आप ड्रिलिंग हो जाएगा.
- गाइड प्रवेशनी निकालें और अपनी ड्रिल बिट बाँझ. ध्यान पेंसिल के निशान पर एक छेद ड्रिल के लिए जब तक आप खोपड़ी की चौड़ाई के माध्यम से मिलता है. गाइड प्रवेशनी के साथ की जाँच करें देखने के लिए अगर यह पक्षों को छू बिना छेद स्पष्ट होगा. ड्रिलिंग और जाँच है जब तक प्रवेशनी एक सीधे रास्ते में स्पष्ट कर सकते हैं रखो. एक बार छेद बनाया जाता है, एक बाँझ सुई का उपयोग करने के लिए धीरे meninges पंच क्रम में प्रवेशनी के unobstructed सम्मिलन की अनुमति.
- दो प्रवेशनी छेद, दो प्रवेशनी छेद, और दो पक्षों को पीछे करने के लिए पार्श्व के लिए पूर्वकाल: अगले, एक हाथ ड्रिल का उपयोग कर, खोपड़ी शिकंजा लिए छह छेद बना. छह शिकंजा जीवाणुरहित और खोपड़ी पर उन्हें जगह है जब तक वे कसकर पर लंगर डाले हैं.
- इथेनॉल और खारा, माउंट के साथ गाइड प्रवेशनी साफ है, और यह उचित वेंट्रल समन्वय के लिए धीरे धीरे कम. यकीन है कि छू पक्षों और नहीं है कि यह पूरी तरह से खड़ी करने जा रहा है.
- लंगर पेंच medially और पीछे खोपड़ी शिकंजा पीछे प्लेस और यह चिमटी के साथ जगह में पकड़. तरल दंत सीमेंट की एक पतली बैच मिक्स और गाइड प्रवेशनी, शिकंजा, और एक बाँझ रंग के साथ खोपड़ी के बाकी को कवर. दूसरे बैच, मोटा इस समय, और पूरी तरह से कवर क्षेत्र और प्रवेशनी और लंगर के लिए पर्याप्त पेंच इसे सुरक्षित बनाओ.
- के रूप में सीमेंट मोटा हो जाता है और पहले यह solidifies, सीमेंट कप से त्वचा और अलग रंग के साथ सीमेंट कप मोल्ड करने के लिए सुनिश्चित करें कि चारों ओर सीमेंट टोपी चिकनी है और करता है बाद में त्वचा में जलन नहीं कर.
- दंत सीमेंट तंत्र से जानवर को हटाने से पहले पूरी तरह से सूखे के लिए अनुमति दें. Hemostats निकालें. Bacitracin सीमेंट टोपी के आसपास सभी तरह लागू करें.
- एक बार जानवर stereotaxic साधन बंद है, पेनिसिलिन आईएम (इंट्रा - पेशी) खारा अनुसूचित जाति (subcutaneously) के 1 मिलीलीटर के द्वारा पीछा 0.25 मिलीलीटर के साथ इंजेक्षन.
- अपने अपने पिंजरे में पशु प्लेस और यह जब तक यह से पहले वह अपने कमरे में लौट ठीक करने के लिए प्रति सचेत हो जाता है पर नजर रखने के.
- जानवरों मॉनिटर जब तक वे सर्जरी और बाद सेशन दैनिक के दिन पर संज्ञाहरण से उबरने में संक्रमण और दर्द / संकट के मूल्यांकन के संकेत के लिए प्रयोग के अंत तक,. इस सप्ताहांत और छुट्टियों शामिल हैं. कम सहज आंदोलन से निपटने पर संकट वोकलिज़ेशन, hunched मुद्रा, दस्त, सूजन और headmount के क्षेत्र, और खिला / पीने के अभाव में निर्वहन दर्द और संकट के सभी लक्षण हैं. Buprenorphine (0.1-0.5mg/kg अनुसूचित जाति) दो बार प्रशासित किया जाता है दैनिक, और फिर, एक आधार के रूप में की जरूरत पर, अगर जानवर दर्द में प्रतीत होता है. स्थानीय एंटीबायोटिक उपचार (bacitracin मरहम) और प्रणालीगत एंटीबायोटिक उपचार (पेनिसिलिन 100,000 / हर 12 घंटे पहले 48 घंटे के बाद सेशन के लिए आईएम आइयू किलो) अगर पोस्ट ऑपरेटिव संक्रमण होते हैं प्रशासित रहे हैं. अगर इन लक्षणों में से किसी buprenorphine, पूरक द्रव के प्रशासन, और सर्जरी के 12 घंटे के भीतर एंटीबायोटिक उपचार के बाद जारी रहती है, जानवर euthanized है.
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Discussion
Vivo microdialysis में रहने वाले एक जानवर के विशिष्ट मस्तिष्क साइटों में एकाधिक न्यूरोट्रांसमीटर और चयापचयों को मापने के लिए पसंद का उपकरण है. लेकिन, यह केवल neurochemicals के कोशिकी स्तर पर नज़र रखता है और यह समय संकल्प नहीं की पेशकश करने के लिए वास्तविक समय में neurotransmitter exocytosis की निगरानी करता है. "शुद्ध प्रवाह" नामक तकनीक का एक संस्करण के माध्यम से, एक दिया साइट पर वास्तविक neurotransmitter एकाग्रता, परिकलित किया जा सकता है, जो बारी में प्लाज्मा झिल्ली ट्रांसपोर्टरों के माध्यम से अवरोध की neurotransmitter दर की सटीक माप दे सकते हैं.
Microdialysis बेसल पशुओं के विभिन्न समूहों (यानी अलग जीनोटाइप) के बीच और neurotransmitter रिहाई पर दवाओं के प्रभाव या अन्य जोड़तोड़ गूढ़ रहस्य में कोशिकी neurotransmitter स्तरों में अंतर illustrating में आदर्श है.
केशिका क्षेत्र वैद्युतकणसंचलन (CZE) फ्लोरोसेंट का पता लगाने के साथ मिलकर की तरह HPLC - चुनाव आयोग के लिए वैकल्पिक assays की शुरूआत के vivo microdialysis में नमूना प्रति एक कुछ मिनट के भीतर समय संकल्प वृद्धि हुई है.
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Acknowledgments
DK065872 (ENP), जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक स्मिथ परिवार उत्कृष्टता के फाउंडेशन पुरस्कार (ENP), DA023760 F31 द्वारा समर्थित है.
Materials
| Materials are described in the protocol document. |
References
- Bungay, P. M., Newton-Vinson, P., Isele, W., Garris, P. A., Justice, J. B. Microdialysis of dopamine interpreted with quantitative model incorporating probe implantation trauma. J. Neurochem. 86, 932-946 (2003).
- Chen, K. C. Effects of tissue trauma on the characteristics of microdialysis zero-net-flux method sampling neurotransmitters. Journal of Theor. Biology. 238, 863-881 (2006).
- Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
- Pothos, E. N., Creese, I., Hoebel, B. G. Restricted eating with weight loss selectively decreases extracellular dopamine in the nucleus accumbens and alters dopamine response to amphetamine, morphine and food intake. The Journal of Neuroscience. 15, 6640-6650 (1995).
