Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie

Published: January 2, 2009 doi: 10.3791/935
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,3, 5, 5, 1,2,3, 1,3
1Department of Cancer Genetics and Developmental Biology, BC Cancer Research Centre, 2Interdisciplinary Oncology Program, University of British Columbia - UBC, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia - UBC, 4Photography/Video Production, Multi-Media Services, BC Cancer Agency, 5Department of Medical Genetics, Life Sciences Institute,, University of British Columbia - UBC
* These authors contributed equally

Summary

Deze video toont het protocol voor gemethyleerd DNA immunoprecipitatie (MeDIP). MeDIP is een twee dagen procedure die selectief gemethyleerd DNA-fragmenten extracten van een genomische DNA-monster met behulp van antilichamen met specificiteit voor 5-methylcytosine (anti-5 mC).

Abstract

De identificatie van DNA-methylatie patronen is een gemeenschappelijke procedure in de studie van de epigenetica, zoals methylatie is bekend dat significante effecten op de genexpressie hebben, en is betrokken bij een normale ontwikkeling en ziekte

Protocol

DNA-extractie en monstervoorbereiding

DNA uit een verscheidenheid van verschillende monsters (gekweekte cellen, vers ingevroren en in formaline gefixeerde paraffine ingebedde weefsels) kan worden gebruikt voor MeDIP. Het is belangrijk om in hoge mate gezuiverd DNA te gebruiken zonder bijbehorende eiwitten zoals histonen. Het is ook belangrijk om zo veel RNA te verwijderen als mogelijk uit de steekproef, als het kan interfereren met zowel DNA kwantificatie en antilichaam bindend. De hoeveelheid DNA gebruikt voor MeDIP kan variëren van 200 ng tot 1 ug, afhankelijk van de hoeveelheid DNA beschikbaar. Om aan te tonen dit protocol, zal 1 ug DNA worden gebruikt. Het volgende protocol zal van hoge kwaliteit dubbelstrengs DNA van gekweekte cellen. Andere protocollen moeten worden gebruikt voor extractie van DNA van andere soorten monsters.

  1. Voeg 400 ul van de spijsvertering buffer naar een cel pellet in een 1,7 ml Eppendorf buis.
  2. Voeg 100 ug van proteïnase K aan de buis, en 's nachts bij 50 ° C. incubeer
  3. Voeg 500 ul fenol pH 7 en meng grondig, maar voorzichtig door om te keren.
  4. Spin bij 13 000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Verwijder de waterige (top) fractie naar een nieuwe buis.
  6. Herhaal stap 3 tot en met 5 keer.
  7. Voeg 500 ul 01:01 fenol / chloroform pH 7 en meng grondig, maar voorzichtig door om te keren.
  8. Spin bij 13 000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  9. Verwijder de waterige (top) fractie naar een nieuwe buis.
  10. Voeg 40 ug van RNase A en incubeer 1 uur bij 37 ° C.
  11. Voeg 500 ul fenol pH 7 en meng grondig, maar voorzichtig door om te keren.
  12. Spin bij 13 000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  13. Verwijder de waterige (top) fractie naar een nieuwe buis.
  14. Herhaal de stappen 11 tot en met 13 keer.
  15. Voeg 500 ul 01:01 fenol / chloroform pH 7 en meng grondig, maar voorzichtig door om te keren.
  16. Spin bij 13 000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  17. Verwijder de waterige (top) fractie naar een nieuwe buis.
  18. Voeg 1/10e volume 3 M natriumacetaat (40 pl) en meng goed.
  19. Voeg 2 volumes (900 pl) van 100% ethanol, goed mengen en plaats bij -20 ° C gedurende 20 minuten.
  20. Spin bij 13 000 g gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
  21. Verwijder de ethanol, pols draaien, en verwijder de resterende ethanol.
  22. Voeg 500 ul koude 70% ethanol te wassen. Spin bij 13 000 g gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
  23. Verwijder 70% ethanol, pols draaien, en verwijder de resterende ethanol door pipetteren.
  24. De lucht droog de pellet met de kap open voor 10 minuten bij kamertemperatuur om alle sporen van de resterende ethanol te verwijderen.
  25. Resuspendeer DNA in 50 ul van gesteriliseerde dH2O overnacht bij 4 ° C.
  26. Kwantificeren van het DNA met behulp van een NanoDrop spectrofotometer. Een A-260: Een 280-verhouding van 1,8 is ideaal.
  27. Bepaal DNA kwaliteit en grootte bereik op een agarose gel met 100 bp ladder. Zo weinig als 10 ng genomisch DNA kan worden uitgevoerd op een 1,7% agarosegel, gevolgd door kleuring met behulp van een kleurstof die zeer gevoelig is voor kleine hoeveelheden DNA, zoals SYBR Gold.
  28. In een gesiliconiseerde tube per monster, 1 ug van DNA in een totaal volume van 50 ui met de rest van het volume uit met gesteriliseerd dH 2 O.

DNA ultrasoonapparaat

DNA sonicatie en het MeDIP het protocol moet worden uitgevoerd in siliconzied-buizen niet specifiek binden van proteïnen aan buiswanden te voorkomen. Optimale sonicatie tijden voor de DNA-monsters zijn gebaseerd op de mate van fragmentatie DNA-monster als bepaald met behulp van gel elektroforese (stap 27). Bijvoorbeeld, moet DNA geëxtraheerd uit gekweekte cellen van een zeer hoog moleculair gewicht, en zal vervolgens vereisen meer duurt dan DNA geëxtraheerd uit archiefmateriaal monsters, die vaak gedeeltelijk afgebroken. Indien monsters zijn van uniform hoog moleculair gewicht, is het redelijk op dit punt door te gaan met de sonicatie zoals beschreven in dit protocol zonder controle van elk monster apart. Indien monsters worden versnipperd en met archiefwaarde monsters, zal het nodig zijn om de ultrasoonapparaat procedure waarschijnlijk door het verlagen van sonicatie keer om 300-100 bp fragmenten te verkrijgen aan te passen. Als u verwacht dat monsters die zijn gedeeltelijk afgebroken, de optimalisering van ultrasoonapparaat parameters kunnen worden uitgevoerd op een representatieve steekproef van die van belang proces. Gebaseerd op de mate van DNA-fragmentatie waargenomen van gelelektroforese (stap 27), kan de onderzoeker vooruit op de optimale sonicatie tijd voor het monster. Hier beschrijven we een methode om 300-1000 bp DNA-fragmenten verkrijgen door sonicatie met een geautomatiseerde sonicating apparaat (Bioruptor van Diagenode, UCD-200 TM) met een hoog moleculair gewicht DNA.

  1. Water in Biorupter moet op 4 ° C.
  2. Sonificeer 7 minuten op de automatische instellingen (30 sec op 30 seconden uit op maximaal vermogen).
  3. Verwijder de 800 ng (40 ul) van gesoniceerd product en plaats in gesiliconiseerde 1,7 ml centrifugebuis voor de immunoprecipitatie (IP) reactie.
  4. Gereserveerd resterende 200 ng (10 ul) om te dienen als input (IN) referentie-DNA (bewaren bij 4 ° C).

    IMMUNOPRECIPITATON van gemethyleerde DNA

    1. Denaturatie van de DNA dat zal voor IP-reactie (800 ng) worden gebruikt bij 95 ° C gedurende 10 minuten in een waterbad.
    2. Koel onmiddellijk op ijs. Volledig te laten afkoelen DNA (ongeveer 5 minuten op het ijs) voordat u verder gaat met de volgende stap.
    3. Voeg 5 ug monoklonaal antilichaam.
    4. Voeg IP-buffer (gebruikt bij kamertemperatuur in dit protocol) tot een eindvolume van 500 pi.
    5. Incubeer 2 uur bij 4 ° C in roterende buis houder.
    6. Vlak voordat stap 5 is voltooid, voor te bereiden Dynabeads door wassen (Steps 6-11). Eerst grondig resuspendeer de kralen in de flacon door vortexen.
    7. Transfer 30 pl (~ 2 x 10 7) van de geresuspendeerde Dynabeads per reactie plus 1, in een nieuwe gesiliconiseerde buis (bijvoorbeeld als het doen 8 reacties, genoeg parels te verwijderen voor 9, dat wil zeggen 270 pi).
    8. Plaats de buis op de magnetische rek voor 2 minuten bij kamertemperatuur.
    9. Pipet uit de bovendrijvende. Bij het verwijderen van supernatant, vermijd contact met de kralen tegen binnenwand (waar de kralen te trekken naar de magneet) met de pipetpunt.
    10. Haal de buis van de magneet, en resuspendeer de kralen in een overmaat volume van IP-buffer (750 ul-1000 pi). Plaats de buis terug op de magnetische rek voor 2 minuten bij kamertemperatuur.
    11. Herhaal het wassen nog een keer, en dan resuspendeer de gewassen kralen in IP buffer in het oorspronkelijke volume verwijderd in stap 7.
    12. Voeg 30 pl gewassen Dynabeads aan elk IP reactie
    13. Incubeer in een draaiende buis houder voor 2 uur bij 4 ° C.
    14. Na incubatie is voltooid, plaatst u de buis op de magnetische rek voor 2 minuten bij kamertemperatuur.
    15. Pipet uit de bovendrijvende. Vermijd het aanraken van de binnenwand van de buis (waar de kralen te trekken naar de magneet) met de pipetpunt. Voeg 500 ul van IP-buffer. Meng de buis inhoud en zet het terug op de magnetische rek voor 2 minuten. Herhaal wassen met 500 ul IP buffer een keer.
    16. Na het verwijderen van het supernatant van de laatste wassen, resuspendeer de kralen in 400 ul van de spijsvertering buffer.
    17. Behandel de reactie met 100 ug van proteïnase K en 's nachts bij 50 ° C. incubeer

    ZUIVERING VAN immunogeprecipiteerd DNA

    1. Voeg 500 ul 01:01 fenol / chloroform pH 7 en vortex grondig.
    2. Spin bij 13 000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Verwijder de waterige (top) fractie naar een nieuwe buis.
    4. Herhaal de stappen 1 tot en met 3 als de interfase tussen de waterige en organische lagen troebel.
    5. Voeg 1 / 10 e deel 3 M natriumacetaat (40 pl) en vortex.
    6. Voeg 1 ui van glycogeen (20 pg / pl) en vortex.
    7. Voeg 2 volumes (1000 pl) van 100% ethanol, vortex, en plaats bij -20 ° C gedurende 20 minuten.
    8. Spin bij 13 000 g gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
    9. Verwijder de ethanol, pols draaien, en verwijder de resterende ethanol.
    10. Voeg 500 ul koude 70% ethanol te wassen. Vortex kort en spin bij 13 000 g gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
    11. Verwijder 70% ethanol, pols draaien, en verwijder de resterende ethanol door pipetteren.
    12. De lucht droog de pellet met de kap open voor 10 minuten bij kamertemperatuur om alle sporen van de resterende ethanol te verwijderen.
    13. Resuspendeer DNA pellet in 10 pi gesteriliseerd dH 2 0.

    Validatie door PCR

    1. U kunt testen om ervoor te zorgen dat uw MeDIP procedure werkt door het uitvoeren van de MeDIP protocol met behulp van normale menselijke DNA (mannelijk of vrouwelijk), en vervolgens het testen van een regio die bekend worden verrijkt voor de methylatie.
    2. Verwijder 30% van de MeDIP product aan PCR tube, en nog eens 30% van de MeDIP product naar een andere PCR buis.
    3. Zet 10 ng van IN DNA in een PCR-buis, en 10 ng van IN DNA in een andere PCR-buis. Je hebt nu vier afzonderlijke PCR-reacties in te stellen.
    4. Voer PCR met behulp van H19 en CTRL primers zoals aangegeven in tabel 1.
    5. Bereid twee mastermixes (een voor elke primer set) voor PCR-reacties met 12,5 ui totaal volume zoals aangegeven in tabel 2.
    6. Thermocycle de PCR met behulp van de voorwaarden vermeld in tabel 3.
    7. Run 5 ul van PCR-producten op een 2% agarosegel voor visualisatie.
    8. De verwachte resultaten voor een succesvolle MeDIP zijn weergegeven in tabel 4.

    Tafels

    Tabel 1: H19 en CTRL primers voor PCR validatie.

    Primer Set Voorwaartse primer Reverse primer Verwachte Product Maat
    H19 H19_F 5'-cgagtgtgcgtgagtgtgag H19_R 5'-ggcgtaatggaatgcttgaa 174 bp
    CTRL (control) CTRL_F5'-gagagcattagggcagacaaa CTRL_R 5'-gttcctcagacagccacattt 139 bp

    Tabel 2. Mastermixes voor PCR-reacties.

    2 O
    H19 Mix (per Rxn) CTRL Mix (per Rxn)
    6.875 6.875
    10X Buffer 1.25 1.25
    dNTP mix (10 mM elk) 0.25 0.25
    MgCl 2 (50 mm) 0.25 0.25
    Primers (H19_F / R of CTRL_F / R) (10 uM elk F / R) 0.625 0.625
    Platinum Taq 0.25 0.25

    Tabel 3. PCR thermocyling voorwaarden.

    95 ° C 05:00
    40X
    		95 ° C 00:30
    56 ° C 00:30
    72 ° C 00:15

    Tabel 4. Verwachte PCR-resultaten voor succesvolle MeDIP.

    Template-DNA
    Primer wordt gebruikt IN IP
    H19 Positief Positief
    CTRL Positief Negatief

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er is een groeiend besef van de belangrijke rol van DNA-methylatie speelt bij de ziekte, zijn daarom de ontwikkeling van assays om deze wijziging te meten steeds belangrijker 3, 12, 13. De MeDIP techniek is een hulpmiddel vatbaar voor het screenen van zowel het hele genoom en locus-specifieke niveau 6, 7. Deze techniek zorgt voor een snelle weergave van DNA-methylatie niveaus met behulp van beperkte hoeveelheden van het starten van DNA en maakt een eenvoudige vergelijkingen tussen verschillende bronnen. Stroomafwaarts applicaties met behulp van het MeDIP product omvatten een scala van micro-arrays zoals hele genoom en CpG eiland oligonucleotide arrays, directe PCR-assays voor loci van belang, evenals sequencing.

MeDIP voorziet in een duidelijke aanpak voor DNA methylatie-detectie die gekoppeld is aan antilichamen om onderscheid te maken gemethyleerd en niet-gemethyleerd DNA 6. Terwijl MeDIP is sneller dan de traditionele benaderingen bisulfiet sequencing en het is niet beperkt tot de analyse van specifieke sequenties, zoals restrictie-enzym analyse zal de immunoprecipitatie afhankelijk zijn van DNA-sequentie met CpG dichtheid, repetitieve element aanwezigheid en samenstelling. Zo, passende controles, zoals bij elk experiment, zijn belangrijk voor de analyse en interpretatie van MeDIP resultaten.

Er zijn verschillende stappen in de MeDIP techniek waarbij extra zorg moet worden genomen. Deze omvatten: het gebruik van gesiliconiseerde buizen van niet-specifieke binding van DNA naar buiswanden te voorkomen, toereikende fragmentatie van DNA na sonificatie, en ervoor te zorgen dat DNA is volledig is gedenatureerd. Bovendien, er rekening mee dat kwantificering van enkelstrengs MeDIP product kan moeilijk worden omdat er een beperkte hoeveelheid materiaal en veel gebruikte technieken voor het schatten van DNA hoeveelheid, zoals spectrofotometrie, het beste werken met double-stranded DNA. Bovendien, is het belangrijk om een ​​goede EU-veiligheidsrichtlijnen praktijken te allen tijde, vooral wanneer bijtende stoffen, zoals fenol worden gebruikt.

De MeDIP techniek kan ook worden gewijzigd op verschillende stappen. Belangrijk is dat het protocol kan worden opgeschaald naar boven of beneden tot hogere opbrengsten, of op het werk toe met een beperkte steekproefomvang. Een alternatieve aanpak versnippering, zoals het gebruik van restrictie-enzymen (bijv. Alu I spijsvertering), vermindert de uitrusting eisen, maar kan ook introduceren vooroordelen mogelijk beperken van DNA naar beneden te trekken in sommige regio's. Net als bij elke aanpak, worden de resultaten best gevalideerd met behulp van een alternatieve benadering voor DNA methylatie-detectie 1, 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Wij willen de leden van de Brown en Lam laboratoria bedanken voor hun deelname aan bekritiseren deze video en artikel. Dit werk werd ondersteund met middelen uit het Canadese Institutes for Health Research en de Michael Smith Foundation for Health Research.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Biorupter sonicator Tool Diagenode UCD-200 TM
1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes Other Sorenson BioScience 11510
ND 3300 Spectrophotometer Tool NanoDrop
Primary Antibody: Anti-5’-methylcytosine mouse mAb Reagent Calbiochem 162 33 D3
Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG Reagent Invitrogen 112-01D
Magnetic Tube Rack Tool Invitrogen CS15000
Mini LabRoller Tool Labnet International H5500
IP Buffer 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature
Digestion Buffer 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
  2. Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
  3. Zilberman, D., Henikoff, S. Genome-wide analysis of DNA methylation patterns. Development. 134, 3959-3965 (2007).
  4. Feinberg, A. P., Tycko, B. The history of cancer epigenetics. Nature reviews. 4, 143-153 (2004).
  5. Weber, M., et al. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat Genet. 39, 457-466 (2007).
  6. Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat Genet. 37, 853-862 (2005).
  7. Wilson, I. M., et al. Epigenomics: mapping the methylome. Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).
  8. Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing. Nature. 449, 1073-1077 (2007).
  9. Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers. Journal of applied. 49, 1-10 (2008).
  10. Maekawa, M., Watanabe, Y. Epigenetics: relations to disease and laboratory findings. Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).
  11. Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. Epigenetics of cancer progression. Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).
  12. Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429, 457-463 (2004).
  13. Jones, P. A., Baylin, S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).
  14. Fraga, M. F., Esteller, M. DNA methylation: a profile of methods and applications. Biotechniques. 33, 632-649 (2002).

Tags

Celbiologie DNA methylatie immunoprecipitatie Epigenomics epigenetica methylcytosine MeDIP protocol 5-methylcytosine antilichaam anti-5-methylcytosine microarray
Gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thu, K. L., Vucic, E. A., Kennett,… More

Thu, K. L., Vucic, E. A., Kennett, J. Y., Heryet, C., Brown, C. J., Lam, W. L., Wilson, I. M. Methylated DNA Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (23), e935, doi:10.3791/935 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter