Summary
וידאו זה מדגים את פרוטוקול ה-DNA immunoprecipitation מפוגל (MeDIP). MeDIP היא הליך יומיים כי סלקטיבי תמציות שברי DNA מפוגל ממדגם הדנ"א הגנומי באמצעות נוגדנים עם ספציפיות עבור 5-methylcytosine (אנטי 5 MC).
Abstract
זיהוי תבניות מתילציה DNA היא הליך שכיח במחקר של אפיגנטיקה, כמו מתילציה ידוע כבעל השפעה משמעותית על ביטוי גנים, והיא מעורבת עם התפתחות המחלה נורמלית, כמו גם
Protocol
ה-DNA מיצוי הכנת המדגם
דנ"א ממגוון רחב של מדגמים שונים (תאים בתרבית, טרי קפוא, כמו גם פורמלין-קבוע רקמות פרפין מוטבע) יכול לשמש MeDIP. חשוב להשתמש DNA מטוהרים ללא חלבונים הקשורים כמו ההיסטונים. חשוב גם כדי להסיר RNA ככל האפשר מן המדגם, כפי שהוא יכול להפריע quantitation הן DNA ו מחייב נוגדנים. כמות ה-DNA המשמש MeDIP יכול לנוע בין 200 ל ng מיקרוגרם 1 בהתאם לכמות ה-DNA זמין. כדי להמחיש זאת בפרוטוקול, 1 מיקרוגרם של ה-DNA ישמשו. פרוטוקול הבאה תספק איכות גבוהה DNA גדילי כפול מתוך תאים בתרבית. פרוטוקולים אחרים צריכים להיות מועסקים להפקת דנ"א מסוגים מדגם אחר.
- הוסף 400 μl של חיץ העיכול על גלולה תא צינור Eppendorf 1.7 מ"ל.
- הוספת 100 מיקרוגרם של proteinase K כדי הצינור, דגירה לילה בשעה 50 ° C.
- הוסף 500 μl פנול pH 7 ומערבבים בעדינות אך ביסודיות על ידי היפוך.
- ספין ב 000 גרם 13 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר חלק מימית (למעלה) אל צינור חדש.
- חזור על שלבים 3 עד 5 פעם.
- הוסף 500 μl pH 01:01 פנול / 7 כלורופורם ומערבבים בעדינות אך ביסודיות על ידי היפוך.
- ספין ב 000 גרם 13 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר חלק מימית (למעלה) אל צינור חדש.
- הוסף 40 מיקרוגרם של RNase A ו דגירה 1 שעות בשעה 37 ° C.
- הוסף 500 μl פנול pH 7 ומערבבים בעדינות אך ביסודיות על ידי היפוך.
- ספין ב 000 גרם 13 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר חלק מימית (למעלה) אל צינור חדש.
- חזור על שלבים 11 עד 13 פעם.
- הוסף 500 μl pH 01:01 פנול / 7 כלורופורם ומערבבים בעדינות אך ביסודיות על ידי היפוך.
- ספין ב 000 גרם 13 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר חלק מימית (למעלה) אל צינור חדש.
- הוספת נפח 1/10th 3 נתרן אצטט M (40 μl) ומערבבים היטב.
- הוסף 2 כרכים (900 μl) של אתנול 100%, לערבב היטב, מקום -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- ספין ב 000 גרם 13 במשך 20 דקות ב 4 ° C.
- הסר אתנול, ספין דופק, ולהסיר אתנול שיורית.
- הוסף 500 μl 70% אתנול קר לשטוף. ספין ב 000 גרם 13 במשך 20 דקות ב 4 ° C.
- הסר אתנול 70%, ספין דופק, ולהסיר אתנול שיורי על ידי pipetting.
- האוויר היבש גלולה עם מכסה פתוח במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את כל עקבות של אתנול שיורית.
- Resuspend-DNA של μl 50 dH2O מעוקרים לילה בשעה 4 ° C.
- לכמת את הדנ"א בעזרת ספקטרופוטומטר NanoDrop. 260: 280 יחס של 1.8 הוא אידיאלי.
- קביעת איכות דנ"א טווח גודל על ג'ל agarose עם סולם 100 נ"ב. משהו כמו 10 ננוגרם של הדנ"א הגנומי ניתן להריץ על 1.7% agarose ג'ל ואחריו מכתים באמצעות צבע כי הוא רגיש מאוד כמויות קטנות של דנ"א כגון זהב SYBR.
- ב הגליל האחד siliconized לפי המדגם, להכין 1 מיקרוגרם של ה-DNA בהיקף כולל של 50 μl עם שאר נפח מורכב עם מעוקרים DH 2 O.
ה-DNA SONICATION
Sonication דנ"א פרוטוקול MeDIP חייב להתבצע בתוך צינורות siliconzied למנוע מחייב ספציפית של חלבונים שאינם קירות צינור. פעמים sonication אופטימלית עבור דגימות DNA מבוססים על מידת הפיצול דגימת DNA כפי שנקבע מן אלקטרופורזה בג'ל (שלב 27). לדוגמה, ה-DNA המופק תאים בתרבית צריך להיות משקל מולקולרי גבוה מאוד, יהיה בהמשך דורשים sonication יותר DNA שנלקחו דגימות ארכיוני אשר לעתים מושפל חלקית. אם הדגימות של משקל מולקולרי גבוה באופן אחיד, סביר בשלב זה להמשיך עם sonication כמתואר בלי לבדוק כל דגימה בנפרד פרוטוקול זה. אם הדגימות מקוטעת כמו עם דגימות ארכיוני, יהיה צורך להתאים את ההליך sonication סביר ידי הפחתת פעמים sonication להשיג 300-100bp שברים. אם אתה מצפה לתהליך דגימות מפורקים חלקית, אופטימיזציה של הפרמטרים sonication יכול להתבצע על מדגם מייצג מאלה של עניין. בהתבסס על מידת הפיצול DNA שנצפה מן ג'ל אלקטרופורזה (שלב 27), הנסיין יכול לקבוע מראש את הזמן sonication אופטימלית למדגם. כאן אנו מתארים שיטה להשיג שברי 300-1000 bp-DNA על ידי sonication עם מכשיר sonicating אוטומטיות (Bioruptor מ Diagenode, UCD-200 TM) באמצעות משקל מולקולרי גבוה DNA.
- מים Biorupter חייב להיות 4 ° C.
- Sonicate במשך 7 דקות על הגדרות אוטומטי (30 שניות על 30 שניות ליד כוח מרבי).
- הסרה של 800 ננוגרם (40 μl) של המוצר במקום sonicated וב siliconized צינור 1.7 מ"ל צנטריפוגות עבור immunoprecipitation (IP) תגובה.
- מניחים בצד הנותרים 200 ננוגרם (10 μl) לשמש קלט (IN) DNA הפניה (חנות ב 4 ° C).
IMMUNOPRECIPITATON של ה-DNA מפוגל
- לפגל את ה-DNA אשר ישמשו עבור התגובה IP (800 ננוגרם) בשעה 95 ° C במשך 10 דקות באמבט מים.
- מצננים מיד על הקרח. בואו DNA מגניב לגמרי (כ 5 דקות על קרח) לפני שתמשיך לשלב הבא.
- הוסף 5 נוגדנים חד שבטיים מיקרוגרם.
- הוסף חוצץ ה-IP (משמש בטמפרטורת החדר במשך פרוטוקול זה) נפח סופי של μl 500.
- דגירה עבור 2 שעות על 4 מעלות צלזיוס מסתובב מחזיק צינור.
- רגע לפני שלב 5 תושלם, להכין Dynabeads ידי שטיפה (שלבים 6-11). ראשית, resuspend החרוזים ביסודיות על ידי בקבוקון vortexing.
- העברת 30 μl (~ 2 x 10 7) Dynabeads resuspended לכל תגובה פלוס 1, לתוך צינור siliconized חדש (למשל, אם עושים 8 תגובות, להסיר חרוזים מספיק 9 μl, כלומר 270).
- מניחים את הצינור על מתלה מגנטי עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- פיפטה את supernatant. בעת הסרת supernatant, אל תיגע חרוזים נגד בתוך הקיר (איפה החרוזים למשוך המגנט) עם קצה פיפטה.
- הוצא את הצינור מתוך המגנט, ו resuspend החרוזים בנפח עודף של חיץ IP (750 μl-1000 μl). מניחים את הצינור בחזרה על המדף מגנטי עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- חזור על לשטוף פעם נוספת, ולאחר מכן resuspend החרוזים שטף במאגר ה-IP בהיקף המקורי הוסר בשלב 7.
- הוסף 30 μl של Dynabeads שטף התגובה לכל IP
- דגירה של בעל צינור מסתובב עבור 2 שעות על 4 ° C.
- לאחר דגירה הושלמה, במקום הצינור על מתלה מגנטי עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- פיפטה את supernatant. הימנע מנגיעה הקיר הפנימי של הצינור (איפה החרוזים למשוך המגנט) עם קצה פיפטה. הוסף 500 μl של חוצץ ה-IP. מערבבים את תכולת שפופרת והחזיר אותו על מתלה מגנטי במשך 2 דקות. חזור על לשטוף עם חיץ 500 IP ul פעם אחת.
- לאחר הסרת supernatant מן לשטוף האחרון, resuspend את החרוזים 400 μl של חיץ העיכול.
- פנקו את התגובה עם 100 מיקרוגרם של proteinase K ו דגירה לילה בשעה 50 ° C.
טיהור DNA IMMUNOPRECIPITATED
- הוסף 500 μl pH 01:01 פנול / 7 כלורופורם ו מערבולת ביסודיות.
- ספין ב 000 גרם 13 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר חלק מימית (למעלה) אל צינור חדש.
- חזור על שלבים 1 עד 3 אם שלבי הביניים בין שכבות מימית ואורגנית מופיע מעוננים.
- מוסיפים 1 / 10 נפח ה 3 נתרן אצטט M (40 μl) ו מערבולת.
- הוסף 1 μl של גליקוגן (20 מיקרוגרם / μl) ו מערבולת.
- הוסף 2 כרכים (1000 μl) של אתנול 100%, וורטקס, ומקום בו -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- ספין ב 000 גרם 13 במשך 20 דקות ב 4 ° C.
- הסר אתנול, ספין דופק, ולהסיר אתנול שיורית.
- הוסף 500 μl 70% אתנול קר לשטוף. בקצרה וורטקס, ואת ספין ב 000 גרם 13 במשך 20 דקות ב 4 ° C.
- הסר אתנול 70%, ספין דופק, ולהסיר אתנול שיורי על ידי pipetting.
- האוויר היבש גלולה עם מכסה פתוח במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את כל עקבות של אתנול שיורית.
- Resuspend DNA גלולה ב μl 10 מעוקרים DH 2 0.
אימות BY PCR
- אתה יכול לבדוק על מנת להבטיח כי הליך MeDIP שלך עובד על ידי ביצוע פרוטוקול MeDIP באמצעות DNA אנושי רגיל (זכר או נקבה), ולאחר מכן assaying אזור ידוע להיות מועשר עבור מתילציה.
- הסרה של 30% מהתוצר MeDIP אל צינור ה-PCR, ועוד 30% של המוצר MeDIP אל צינור אחר PCR.
- שים 10 ng של IN-DNA לתוך צינור ה-PCR, ו - 10 ננוגרם של IN-DNA לתוך צינור אחר PCR. אתה צריך עכשיו יש ארבעה תגובות נפרדות PCR להגדיר.
- בצע באמצעות PCR H19 ו CTRL primers כמפורט בטבלה 1.
- להכין שתי mastermixes (אחד עבור כל קבוצה פריימר) לתגובות PCR עם נפח 12.5 הכולל μl כפי שמתואר בטבלה 2.
- Thermocycle PCR באמצעות התנאים המפורטים בטבלה 3.
- הפעלה 5 μl של מוצרי ה-PCR על ג'ל agarose 2% עבור להדמיה.
- התוצאות הצפויות MeDIP מוצלח מוצגים בלוח 4.
טבלאות
טבלה 1: H19 ו CTRL primers עבור אימות PCR.
פריימר הגדר קדימה פריימר הפוך פריימר מוצר הצפוי גודל H19 H19_F 5'-cgagtgtgcgtgagtgtgag H19_R 5'-ggcgtaatggaatgcttgaa 174 נ"ב CTRL (שליטה) CTRL_F5'-gagagcattagggcagacaaa CTRL_R 5'-gttcctcagacagccacattt 139 נ"ב טבלה 2. Mastermixes לתגובות PCR.
H19 מערבבים (לכל Rxn) CTRL מערבבים (לכל Rxn) 6.875 6.875 10X הצפת 1.25 1.25 dNTP לערבב (10 mM כל אחת) 0.25 0.25 MgCl 2 (50 מ"מ) 0.25 0.25 Primers (H19_F / R או CTRL_F / R) (10 מיקרומטר כל F / R) 0.625 0.625 פלטינום תקי 0.25 0.25 לוח 3. PCR thermocyling תנאים.
95 ° C 05:00 40X 95 ° C 00:30 56 ° C 00:30 72 ° C 00:15 טבלה 4. תוצאות צפויות PCR עבור MeDIP מוצלח.
תבנית ה-DNA פריימר משמש IN IP H19 חיובי חיובי CTRL חיובי שלילי
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנה מודעות הולכת וגוברת של ה-DNA משחק תפקיד משמעותי מתילציה של המחלה, ולכן פיתוח של מבחני למדוד שינוי זה הם הופכים חשובים יותר ויותר 3, 12, 13. הטכניקה MeDIP הוא כלי נוח להקרנה על הגנום כולו, הן לבין מוקד ספציפי ברמה 6, 7. טכניקה זו מספקת תצוגה מהירה של מתילציה רמות ה-DNA באמצעות כמויות מוגבלות של החל דנ"א מאפשר השוואה קלה בין מקורות שונים. יישומים Downstream השימוש במוצר MeDIP כוללים מגוון של microarrays כגון גנום שלם CPG oligonucleotide מערכים אי, ישיר מבחני PCR עבור לוקוסים של עניין, כמו גם רצף.
MeDIP מספק גישה שונות לגילוי הדנ"א מתילציה כי מסתמך על נוגדנים להבחין מפוגל ו unmethylated DNA 6. בעוד MeDIP הוא מהיר יותר מאשר גישות מסורתיות bisulfite רצף והוא אינו מוגבל בניתוח רצפים ספציפיים כמו ניתוח אנזים הגבלה, immunoprecipitation יהיה תלוי רצף הדנ"א כולל צפיפות CPG, נוכחות אלמנט חוזרות הרכב. כך, בקרות מתאימות, כמו בכל ניסוי, יש חשיבות לניתוח ופרשנות של תוצאות MeDIP.
ישנם מספר צעדים בכל הטכניקה MeDIP שם משנה זהירות יש לנקוט. אלה כוללים: את השימוש של צינורות siliconized כדי למנוע אי - ספציפי המחייב של ה-DNA כדי קירות צינור; הבטחת הפיצול נאותה של ה-DNA לאחר sonication, ולהבטיח כי ה-DNA הוא מפוגל לחלוטין. בנוסף, מציינים כי כימות של מוצר יחיד תקועים MeDIP עלול להיות קשה כי יש כמות מוגבלת של חומרים וטכניקות משותפים רבים להערכת כמות ה-DNA, כגון לספקטרופוטומטריה, העבודה הטובה ביותר עם גדילי הדנ"א הכפול. בנוסף, חשוב להתבונן נכונה על נוהלי בטיחות במעבדה בכל עת, במיוחד כאשר חומרים צורבים כמו פנול משמשים.
הטכניקה MeDIP גם יכול להיות שונה בכל כמה צעדים. חשוב לציין בפרוטוקול תשודרג כלפי מעלה או מטה כדי לאפשר התשואות עלו, או לעבוד עם גודל מדגם מוגבל. גישת הפיצול חלופיים, כגון שימוש של אנזימי הגבלה (למשל עיכול Alu אני), מפחיתה את דרישות ציוד, אך ניתן גם להציג הטיות פוטנציאל למשוך למטה הגבלת DNA באזורים מסוימים. כמו עם כל גישה, התוצאות תוקף הטובה ביותר באמצעות גישה חלופית לגילוי הדנ"א מתילציה 1, 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מבקשים להודות לחברי בראון לאם מעבדות עבור השתתפותם בביקורת זו וידאו במאמר. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מן המכונים הקנדי לחקר הבריאות מייקל סמית הקרן לחקר בריאות.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Other | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
| Primary Antibody: Anti-5’-methylcytosine mouse mAb | Reagent | Calbiochem | 162 33 D3 | |
| Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
| IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
| Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
References
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
- Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
- Zilberman, D., Henikoff, S. Genome-wide analysis of DNA methylation patterns. Development. 134, 3959-3965 (2007).
- Feinberg, A. P., Tycko, B. The history of cancer epigenetics. Nature reviews. 4, 143-153 (2004).
- Weber, M., et al. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat Genet. 39, 457-466 (2007).
- Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat Genet. 37, 853-862 (2005).
- Wilson, I. M., et al. Epigenomics: mapping the methylome. Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).
- Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing. Nature. 449, 1073-1077 (2007).
- Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers. Journal of applied. 49, 1-10 (2008).
- Maekawa, M., Watanabe, Y. Epigenetics: relations to disease and laboratory findings. Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).
- Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. Epigenetics of cancer progression. Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429, 457-463 (2004).
- Jones, P. A., Baylin, S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).
- Fraga, M. F., Esteller, M. DNA methylation: a profile of methods and applications. Biotechniques. 33, 632-649 (2002).
