Summary
AD의 형질 (TG) 마우스 모델을 어떻게 그리고 왜 Aβ 또는 타우 수준 CSF의 변화에 질병이 인간의 환자에서 진행됨에 따라 조사를 위해 좋은 기회를 제공합니다. 여기, 우리는 마우스 시리얼 CSF 샘플링을위한 세련된 cisterna 마그나 찔린 기법을 보여줍니다.
Abstract
알츠하이머 병 (AD)는 병적 β - 아밀로이드 펩티드 (Aβ)와 hyperphosphorylated 타우 단백질의 세포외 intraneuronal 축적의 증착에 의해 특징 진보적인 neurodegenerative 질병입니다. 중추 신경계 (CSF)는 두뇌의 세포외 공간에 직접 접촉하기 때문에, 그것은 병적인 과정에 대한 응답으로 뇌의 생화학 변화의 반영을 제공합니다. 이러한 변화에 책임이있는 메커니즘이 아직 완전히 이해되지 않습니다하지만 AD 환자의 CSF는 42 아미노 산성 Aβ (Aβ42)의 형태, 총 타우와 타우 hyperphosphorylated 증가에서 감소를 보여줍니다. AD의 형질 (TG) 마우스 모델을 어떻게 그리고 왜 Aβ 또는 타우 수준 CSF의 변화에 질병이 진행됨에 따라 조사에 좋은 기회를 제공합니다. 여기, 우리는 마우스 CSF 샘플링을위한 세련된 cisterna 마그나 찔린 기법을 보여줍니다. 이것은 매우 부드러운 샘플링 기술은 시리얼 CSF 샘플이 크게 시간이 지남에 따라 미묘한 변경을 감지하는 것이 가능하게, Aβ 또는 타우 수준 사이 마우스 변화의 혼란함을 주죠 효과를 최소화 2~3개월 간격으로 같은 마우스에서 구할 수 있습니다. Aβ 및 타우 엘리사와 함께이 기술은 AD 마우스 모델에서 뇌의 CSF Aβ42과 타우의 수준 사이의 관계, 그들의 신진 대사를 조사하기위한 연구에 유용합니다. TG 생쥐의 연구 모니터링 질병 진행에 대한 생물 학적 마커로 사용할 수 CSF의 Aβ 또는 타우 수준의 잠재적으로 중요한 검증을 제공할 수있다, 그리고 치료 개입의 효과를 모니터합니다. 생쥐가 희생될 수 있고 두뇌가 생화학 또는 histological 변경 검사를 할 수 있듯이, CSF 변경 기본 메커니즘은 더 나은 평가하실 수 있습니다. 이 데이터는 인간의 광고 CSF 변경의 해석에 대한 정보를 수있다.
Protocol
유리 모세관 튜브를 풀링
- 유리 모세관은 셔터 악기 부동산 (Borosilicate 유리, B100 - 75 - 10)에서 구입할 수 있습니다.
- 서터에서 P - 87 300 세트 열을 색인과 330에 설정된 압력 지수와 micropipette 풀러 플라밍. 모세관 튜브를 당겨
- 테이퍼 팁에 대해 0.5 mm의 내경을 가지고 있도록, 가위로 유리 모세관 튜브의 끝부분을 낸다.
CSF에 대한 Cisterna 마그나 찔린 기술
CSF 샘플은 cisterna 마그나 (그림 1) 이전에 한 출판 되었음 방법을 사용에서 가져옵니다. 
그림 1
1. 생쥐에 마취제 (100mg/kg)과 xylazine (10mg/kg), 관리 intraperitoneally에 의해 anesthesized 있습니다. 마취 유도의 기간 동안, 생쥐는 37 O C 인큐베이터에 보관됩니다.
2. 목 피부는 면도 있으며, 마우스는 다음 손난로의 직접적인 접촉과 stereotaxic 악기에 경향이 배치됩니다. 가열 패드에 의해 생산되는 열을 체온의 변화에 대응 조정되도록 직장 온도 프로브는 항문에 삽입됩니다. 머리는 머리 어댑터 보안입니다. 외과 사이트는 70 %의 에탄올 (3 번 반복) 다음, 10 % povidone의 요오드로 채취하고, 피부의 화살 절개는 후두에 열등 이루어집니다.
3. 해부 현미경 아래 피하 조직과 근육이 (M. biventer cervicis 및 M. rectus capitis 발등 전공) 포셉과 무딘 절개로 구분됩니다. microretractors의 두 사람이 떨어져 근육을 보유하는 데 사용됩니다.
4. 마우스는 머리가 시체와 함께 거의 135 O 각도를 형성 있도록 누웠지입니다.
5. 해부 현미경 아래에서 cisterna 마그나의 두라 메이터은 모수의 oblongata 및 주요 혈관 (arteria 발등 spinalis) 및 CSF의 공간 (그림 2) 표시되는를 통해 반짝 이는 맑은 역방향 삼각형으로 나타납니다. 
그림 2
6. 두라 메이터는 멸균 면봉과 건조 blotted 있습니다. arteria 발등 spinalis (그림 2) 측면 두라 메이터를 통해 citerna 마그나에 모세관에 침투. 모세관 튜브 삽입에 저항에 눈에 띄게 변화에 따라, CSF는 모세관으로 흐르고 있습니다.
7. 조심스럽게 모세관 튜브를 제거하고 1mm 내경을 가진 폴리에틸렌 튜브를 통해 3 ML의 주사기에 연결합니다. 미리 표시 0.5 ML eppendorf 튜브에 CSF를 주사하고, 드라이 아이스에 즉시 튜브를 동결하고 -80 ° C 냉동고에 그것을 전송합니다.
8. CSF 샘플링 후, 근육이 다시 정렬하며, 피부가 (4-0, Ethicon, 존슨 앤 존슨) 봉합합니다. 0.9 % NaCl의 약 1 ML은 드 수화를 방지하기 위해 subcutaneously 주입니다. 마우스가 복구까지 체온을 유지하기 위해 인큐베이터에 보관되며 마우스의 무게는 1 일, 그리고 수술 후 일주를 감시하고 있습니다.
결과 및 토론
우리는 감지 플라즈마 오염없이 마우스에서 CSF의 시리얼 샘플링에 대한 신뢰성이 높은 프로토콜을 설명했다.
1. 전체 절차는 일반적으로 마우스를 따라 10 분 (마취 포함) 정도 소요됩니다. CSF 획득의 볼륨 마우스 변종에 따라 좌우됩니다. P301L (JNPL3) 마우스 3 10 μl - 15 μl의 수율을 제공하면서 2를 사용하여 PS / APP 더블 TG 생쥐에서 평균 거래량이 5 μl (3-7 μl)입니다. 시리얼 샘플링의 경우, 7-8 μl의 최대 안전 2~3개월의 간격으로 각각의 시간을 촬영하실 수 있습니다.
2. 수술하는 동안, 그것은 cisterna 마그나의 두라 메이터이 충분히 노출 수 있도록 stereotaxic 프레임에서 제대로 마우스의 머리와 신체를 위치하는 것이 중요합니다. ApoB 4 immunoblotting하여 CSF 샘플에서 모니터링할 수 있습니다 플라즈마 단백질에서 오염을 방지하기 위해 모세관으로 두라 메이터을 관통 때 신중하게 혈관을 피하십시오.
3. 조직의 교착은 다음 샘플링을 위해 predisposing 출혈로 어려움을 높일 수있는 각각의 수술시 조직 손상을 최소화하는 것이 중요합니다.
4. 마취로 인한 저체온증은 상당히 매우 빠르게 5 두뇌에 phosphorylated 타우 수준에 영향을 미칠 수 있기 때문에 체온이 잘 수술하는 동안 유지되어야합니다.
5. 우리가 사용하는 AB 엘리사 프로토콜과 항체는 Refolo 외에 자세히 설명했다. 6. 1:50-1:60 희석 때 PS / APP 생쥐에서 CSF의 두 μl는 만족스러운 결과를 줄 것이다. 타우 엘리사 들어, P301L (JNPL3) 생쥐 4-5 μl CSF는 충분합니다총 타우, 또는 타우의 검출 인광 물질은 트레오닌에서 ylated 231 (키트는 바이오 - 소스에서 구입).
6. 이 기술은 CSF의 작은 볼륨이 원하는 assays에 대해 만족하는 대한 신경 질환의 다른 마우스 모델에 적용할 수 있습니다.
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Discussion
우리는 감지 플라즈마 오염없이 마우스에서 CSF의 시리얼 샘플링에 대한 신뢰성이 높은 프로토콜을 설명했다.
1. 전체 절차는 일반적으로 마우스를 따라 10 분 (마취 포함) 정도 소요됩니다. CSF 획득의 볼륨 마우스 변종에 따라 좌우됩니다. P301L (JNPL3) 마우스 3 μl - 15 10 μl의 수율을 제공하면서 우리가 used2 PS / APP 더블 TG 생쥐에서 평균 거래량이 5 μl (3-7 μl)입니다. 시리얼 샘플링의 경우, 7-8 μl의 최대 안전 2~3개월의 간격으로 각각의 시간을 촬영하실 수 있습니다.
2. 수술하는 동안, cisterna 마그나의 두라 메이터이 충분히 노출 수 있도록 stereotaxic 프레임에서 제대로 마우스의 머리와 신체를 위치하는 것이 중요합니다. ApoB 4 immunoblotting하여 CSF 샘플에서 모니터링할 수 있습니다 플라즈마 단백질에서 오염을 방지하기 위해 모세관으로 두라 메이터을 관통 때 신중하게 혈관을 피하십시오.
3. 조직의 교착은 다음 샘플링을 위해 predisposing 출혈로 어려움을 높일 수있는 각각의 수술시 조직 손상을 최소화하는 것이 중요합니다.
4. 마취로 인한 저체온증은 상당히 매우 빠르게 5 두뇌에 phosphorylated 타우 수준에 영향을 미칠 수 있기 때문에 체온이 잘 수술하는 동안 유지되어야합니다.
5. 우리가 사용하는 AB 엘리사 프로토콜과 항체는 Refolo 외에 자세히 설명했다. 6. 1:50-1:60 희석 때 PS / APP 생쥐에서 CSF의 두 μl는 만족스러운 결과를 줄 것이다. 트레오닌 231에서 phosphorylated 타우 엘리사, 마우스 총 타우의 검출에 충분합니다 P301L (JNPL3) 4-5 μl CSF, 또는 타우 (국가 키트는 바이오 - 소스에서 구입).
6. 이 기술은 CSF의 작은 볼륨이 원하는 assays에 대해 만족하는 대한 신경 질환의 다른 마우스 모델에 적용할 수 있습니다.
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Acknowledgments
우리 작품은 NIH 보조금 NS048447 및 AG017216to KD에 의해 지원됩니다. 리 리우는 원래 프로토콜의 개발 기간 동안 자신의 감독 및 지원에 대한 박사 Heikki Tanila을 (쿠오 피오 대학, 쿠오 피오, 핀란드) 감사드립니다.
References
- Liu, L., et al. Longitudinal observation on CSF Abeta42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol Dis. 17, 516- (2004).
- Holcomb, L., et al. Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes. Nat Med. 4, 97 (1998).
- Lewis, J., et al. Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein. Nat Genet. 25, 402- (2000).
- DeMattos, R. B., et al. Plaque-associated disruption of CSF and plasma amyloid-beta (Abeta) equilibrium in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurochem. 81, 229 (2002).
- Planel, E., et al. Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia. J Neurosci. 27, 3090 (2007).
- Refolo, L. M., et al. A cholesterol-lowering drug reduces beta-amyloid pathology in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 8, 890 (2001).
