Summary
Transgénicos (Tg) los modelos de ratón de Alzheimer proporcionan una excelente oportunidad para investigar cómo y por qué los niveles de Aß y tau en el cambio CSF conforme progresa la enfermedad en pacientes humanos. Este sentido, demuestran una refinada técnica de punción cisterna magna para el muestreo de LCR de serie del ratón.
Abstract
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva que es caracterizada patológicamente por depósito extracelular de péptidos β-amiloide (Aß) y la acumulación intraneuronal de proteína tau hiperfosforilada. Debido a que el líquido cefalorraquídeo (LCR) está en contacto directo con el espacio extracelular del cerebro, que proporciona un reflejo de los cambios bioquímicos en el cerebro en respuesta a procesos patológicos. LCR de pacientes con EA muestra una disminución de los 42 aminoácidos forma de Aß (Aß42), y el aumento de tau total y tau hiperfosforilada, aunque los mecanismos responsables de estos cambios aún no se entienden completamente. Transgénicos (Tg) los modelos de ratón de Alzheimer proporcionan una excelente oportunidad para investigar cómo y por qué los niveles de Aß y tau en el LCR cambio a medida que progresa la enfermedad. Este sentido, demuestran una refinada técnica de punción cisterna magna para el muestreo de la enfermedad por el ratón. Esta técnica de muestreo muy suave permite que las muestras de LCR en serie que se obtenga de el mismo ratón a intervalos de 2-3 meses, que minimiza en gran medida el efecto de confusión de la variabilidad entre el ratón en los niveles de Aß o tau, por lo que es posible detectar alteraciones sutiles en el tiempo. En combinación con Aß y ELISA tau, esta técnica será útil para los estudios diseñados para investigar la relación entre los niveles de CSF Aß42 y tau, y su metabolismo en el cerebro en modelos de ratón de Alzheimer. Los estudios en ratones Tg podría proporcionar validación importante en cuanto a la posibilidad de Aß CSF o los niveles de tau para ser utilizados como marcadores biológicos de progresión de la vigilancia de las enfermedades, y para controlar el efecto de las intervenciones terapéuticas. Como los ratones pueden ser sacrificados y los cerebros pueden ser examinadas por los cambios bioquímicos o histológicos, los mecanismos subyacentes a los cambios del LCR puede ser mejor evaluado. Estos datos pueden ser de carácter informativo para la interpretación de los cambios humanos AD CSF.
Protocol
Tirar del tubo capilar de vidrio
- El tubo capilar de vidrio se compra a La Inc Sutter Instrument (vidrio borosilicato, B100-75-10).
- Tire de los tubos capilares en un Sutter P-87 Flaming micropipeta extractor, con el índice de calor en 300 y el índice de presión de 330.
- Recorte el extremo del tubo capilar de vidrio con unas tijeras, de modo que la punta cónica tiene un diámetro interior de 0,5 mm.
Cisterna magna técnica de punción de líquido cefalorraquídeo
Muestras de LCR se han tomado de la cisterna magna (Figura 1) utilizando un método que se publicó anteriormente 1. 
Figura 1
1. Los ratones son anestesiados por la ketamina (100mg/kg) y xilazina (10mg/kg), administrado por vía intraperitoneal. En el momento de la inducción de la anestesia, los ratones se mantienen en una incubadora a 37 ° C.
2. La piel del cuello se afeita, y el ratón se coloca boca abajo en el instrumento estereotáxico con el contacto directo de una almohadilla eléctrica. Una sonda de temperatura rectal se inserta en el recto para que el calor producido por la almohadilla se ajusta en respuesta a los cambios de la temperatura corporal. La cabeza está protegida con los adaptadores de la cabeza. El lugar de la cirugía se limpia con povidona yodada al 10%, seguido por 7 0% de etanol (repetir 3 veces), y una incisión sagital de la piel se hace inferior a la protuberancia occipital.
3. Bajo el microscopio de disección, el tejido subcutáneo y músculos (m. Biventer cervicis de m. recto dorsal mayor capitis) son separados por una disección roma con una pinza. Un par de microretractors se utiliza para mantener los músculos de distancia.
4. El ratón se establece de manera que la cabeza forma un ángulo de casi 135 o con el cuerpo.
5. Bajo el microscopio de disección, la duramadre de la cisterna magna se presenta como un triángulo inverso brillante y clara a través del cual el bulbo raquídeo y un vaso sanguíneo principal (arteria espinales dorsales), y el espacio del LCR son visibles (Figura 2). 
Figura 2
6. La duramadre es borrado en seco con un hisopo de algodón estéril. Penetrar en el tubo capilar en el Citerna magna a través de la duramadre, lateral a la arteria espinales dorsales (Figura 2). Después de un cambio notable en la resistencia a la inserción de un tubo capilar, el LCR fluye dentro del tubo capilar.
7. Retire con cuidado el tubo capilar, y conectarlo a una jeringa de 3 ml a través de un tubo de polietileno que tiene un diámetro interno de 1 mm. Inyectar el líquido cefalorraquídeo en un pre-marcadas tubo eppendorf de 0,5 ml y congelar inmediatamente el tubo en hielo seco y luego la transfiere en una -80 ° C congelador.
8. Después de tomar muestras de LCR, los músculos se vuelven a alinear, y la piel se sutura (4-0, Ethicon, Johnson & Johnson). Aproximadamente 1 ml de NaCl al 0,9% que se inyecta por vía subcutánea para evitar de deshidratación. El ratón se mantiene en la incubadora para mantener la temperatura corporal hasta que se recupere, el peso del ratón se controla un día y una semana después de la cirugía.
Resultados y Discusión
Se describe un protocolo de alta fiabilidad para la toma de muestras de LCR en serie de los ratones sin contaminación detectable en plasma.
1. El procedimiento completo generalmente toma 10 minutos por ratón (incluyendo la anestesia). El volumen de líquido cefalorraquídeo obtenido depende de las cepas de ratones. En el PS / APP ratones Tg doble usamos 2, el volumen promedio es de aproximadamente 5 l (3 a 7 l), mientras que el P301L (JNPL3) 3 ratones dan un rendimiento de alrededor de 10 l-15 l. Para el muestreo de serie, un máximo de 8.7 l puede tomar de manera segura cada vez que en un intervalo de 2-3 meses.
2. Durante la cirugía, es importante la posición de la cabeza y el cuerpo del ratón correctamente en el marco estereotáxico para que la duramadre de la cisterna magna puede estar expuesto lo suficiente. Evita cuidadosamente los vasos sanguíneos cuando penetra en la duramadre con el tubo capilar para prevenir la contaminación de las proteínas plasmáticas, que pueden ser monitoreados en la muestra de LCR por inmunotransferencia de ApoB 4.
3. Reducir al mínimo el daño a los tejidos durante cada cirugía es importante, ya que conglutinación tejido puede aumentar la dificultad por el sangrado de predisposición para la toma de muestras siguientes.
4. La temperatura del cuerpo necesita para mantenerse en buen estado durante la cirugía debido a una hipotermia causada por la anestesia puede afectar significativamente los niveles de tau fosforilada en el cerebro muy rápidamente 5.
5. El Ab ELISA protocolo y los anticuerpos que se utilizaron fueron descritas en detalle en Refolo et al. 6. Dos l de líquido cefalorraquídeo de los ratones PS / APP dará resultados satisfactorios cuando se diluye 1:50-1:60. ELISA para la tau, 4-5 l de LCR P301L (JNPL3) los ratones será suficiente para lala detección del total de tau, tau o fósforo ylated en treonina 231 (Los kits son adquiridos de Bio-Fuente).
6. Esta técnica se puede aplicar a otros modelos de ratón de las enfermedades neurológicas, por lo que un pequeño volumen de LCR es satisfactorio para los ensayos que desee.
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Discussion
Se describe un protocolo de alta fiabilidad para la toma de muestras de LCR en serie de los ratones sin contaminación detectable en plasma.
1. El procedimiento completo generalmente toma 10 minutos por ratón (incluyendo la anestesia). El volumen de líquido cefalorraquídeo obtenido depende de las cepas de ratones. En el PS / APP ratones Tg doble que used2, el volumen promedio es de aproximadamente 5 l (3 a 7 l), mientras que el P301L (JNPL3) 3 ratones dan un rendimiento de alrededor de 10 l-15 l. Para el muestreo de serie, un máximo de 8.7 l puede tomar de manera segura cada vez que en un intervalo de 2-3 meses.
2. Durante la cirugía, es importante la posición de la cabeza y el cuerpo del ratón correctamente en el marco estereotáxico para que la duramadre de la cisterna magna puede estar expuesto lo suficiente. Evita cuidadosamente los vasos sanguíneos cuando penetra en la duramadre con el tubo capilar para prevenir la contaminación de las proteínas plasmáticas, que pueden ser monitoreados en la muestra de LCR por inmunotransferencia de ApoB 4.
3. Reducir al mínimo el daño a los tejidos durante cada cirugía es importante, ya que conglutinación tejido puede aumentar la dificultad por el sangrado de predisposición para la toma de muestras siguientes.
4. La temperatura del cuerpo necesita para mantenerse en buen estado durante la cirugía debido a una hipotermia causada por la anestesia puede afectar significativamente los niveles de tau fosforilada en el cerebro muy rápidamente 5.
5. El Ab ELISA protocolo y los anticuerpos que se utilizaron fueron descritas en detalle en Refolo et al. 6. Dos l de líquido cefalorraquídeo de los ratones PS / APP dará resultados satisfactorios cuando se diluye 1:50-1:60. ELISA para la tau, CSF 5.4 l de P301L (JNPL3) los ratones será suficiente para la detección de la proteína tau total, o tau fosforilado en treonina 231 (Los kits son adquiridos de Bio-Fuente).
6. Esta técnica se puede aplicar a otros modelos de ratón de las enfermedades neurológicas, por lo que un pequeño volumen de LCR es satisfactorio para los ensayos que desee.
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Acknowledgments
Nuestro trabajo es apoyado por el NIH subvenciones NS048447 y KD AG017216to. Li Liu gustaría agradecer al Dr. Heikki Tanila (Universidad de Kuopio, Kuopio, Finlandia) para su supervisión y apoyo durante el desarrollo del protocolo original.
References
- Liu, L., et al. Longitudinal observation on CSF Abeta42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol Dis. 17, 516- (2004).
- Holcomb, L., et al. Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes. Nat Med. 4, 97 (1998).
- Lewis, J., et al. Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein. Nat Genet. 25, 402- (2000).
- DeMattos, R. B., et al. Plaque-associated disruption of CSF and plasma amyloid-beta (Abeta) equilibrium in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurochem. 81, 229 (2002).
- Planel, E., et al. Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia. J Neurosci. 27, 3090 (2007).
- Refolo, L. M., et al. A cholesterol-lowering drug reduces beta-amyloid pathology in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 8, 890 (2001).
