Summary
Transgene (Tg) Mausmodellen der Alzheimer bieten eine ausgezeichnete Gelegenheit, um zu untersuchen, wie und warum Aß oder tau-Spiegeln im Liquor ändern, wenn die Krankheit fortschreitet bei menschlichen Patienten. Hier zeigen wir eine raffinierte Cisterna magna Punktionstechnik für serielle CSF Probenahme aus die Maus.
Abstract
Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, die pathologisch durch extrazelluläre Ablagerung von β-Amyloid-Peptid (Aß) und intraneuronale Ansammlung von hyperphosphorylierte Tau-Protein ist aus. Da Liquor (CSF) ist in direktem Kontakt mit dem extrazellulären Raum des Gehirns, bietet es eine Reflexion der biochemischen Veränderungen im Gehirn als Reaktion auf pathologische Prozesse. CSF von AD-Patienten zeigt eine Abnahme in den 42 Aminosäure-Form von Aß (Aß42), und erhöht in Gesamt-tau und hyperphosphorylierte tau, obwohl die Mechanismen, die für diese Veränderungen noch nicht vollständig verstanden. Transgene (Tg) Mausmodellen der Alzheimer bieten eine ausgezeichnete Gelegenheit, um zu untersuchen, wie und warum Aß oder tau-Spiegeln im Liquor ändern, wenn die Krankheit fortschreitet. Hier zeigen wir eine raffinierte Cisterna magna Punktionstechnik für CSF Probenahme aus die Maus. Diese äußerst schonende Sampling-Technik ermöglicht serielle CSF Proben aus der gleichen Maus Abstand von 2-3 Monaten die stark minimiert die verwirrende Wirkung der zwischen-Maus-Variabilität in Aß oder tau-Spiegeln, die es ermöglicht, subtile Veränderungen im Laufe der Zeit zu erkennen eingeholt werden. In Kombination mit Aß und Tau-ELISA, wird diese Technik nützlich sein Studium konzipiert, um die Beziehung zwischen den Ebenen der CSF Aß42 und Tau, und deren Stoffwechsel im Gehirn in AD Mausmodellen untersuchen. Studies in Tg Mäusen konnten wichtige Bestätigung, um das Potenzial der CSF Aß oder tau-Spiegeln als biologische Marker für die Überwachung der Krankheitsprogression verwendet werden kann, und um die Wirkung von therapeutischen Interventionen zu überwachen. Da die Mäuse geopfert und das Gehirn kann für biochemische oder histologische Veränderungen untersucht werden, können die zugrunde liegenden Mechanismen der CSF Veränderungen besser beurteilt werden kann. Diese Daten sind wahrscheinlich informative zur Interpretation der menschlichen AD CSF Veränderungen.
Protocol
Pulling der Glaskapillare
- Die Glaskapillare ist von der Sutter Instrument Inc (Borosilikatglas, B100-75 bis 10) gekauft.
- Ziehen Sie die Kapillaren auf einer Sutter P-87 Flaming Mikropipette Abzieher, mit der Hitze Index 300 gesetzt und der Druck Index bei 330 gesetzt.
- Schneiden Sie die Spitze des Glaskapillare mit einer Schere, so dass die verjüngte Spitze einen Innendurchmesser von etwa 0,5 mm hat.
Cisterna magna Punktionstechnik für CSF
CSF-Proben werden aus der Cisterna magna (Abb. 1) mit einer Methode, die zuvor 1 wurde veröffentlicht wurde. 
Abbildung 1
1. Die Mäuse werden von Ketamin (100mg/kg) und Xylazin (10mg/kg), intraperitoneal narkotisiert. Während der Zeit der Narkose werden die Mäuse in einem 37 o C Brutschrank gehalten.
2. Die Haut des Halses ist rasiert, und die Maus wird dann gelegt in Bauchlage auf der stereotaktischen Instrument mit direktem Kontakt von einem Heizkissen. Eine rektale Temperatursonde in den Enddarm eingeführt, so dass die Wärme durch das Heizkissen produziert als Reaktion auf die Veränderungen der Körpertemperatur angepasst ist. Der Kopf ist mit dem Kopf Adapter gesichert. Die Operationsstelle wird mit 10% Povidon-Jod abgetupft, gefolgt von 7 0% Ethanol (3 Mal wiederholen) und eine sagittale Inzision der Haut wird schlechter als das Hinterhaupt.
3. Unter dem Dissektionsmikroskop, das subkutane Gewebe und Muskeln (m. biventer cervicis und M. rectus capitis dorsalis major) sind stumpf mit einer Pinzette getrennt. Ein Paar microretractors wird verwendet, um die Muskeln auseinander zu halten.
4. Die Maus ist unten so gelegt, dass der Kopf eine fast 135 o Winkel mit dem Körper bildet.
5. Unter dem Dissektionsmikroskop, erscheint die Dura mater der Cisterna magna als glänzend und klar reverse Dreiecks, durch die der Medulla oblongata und ein wichtiges Blutgefäß (Arteria dorsalis spinalis) und der CSF Raum sichtbar sind (Abbildung 2). 
Abbildung 2
6. Die Dura mater ist trocken getupft mit sterilen Wattestäbchen. Dringen in die Kapillare in die citerna magna durch die Dura mater, lateral der Arteria dorsalis spinalis (Abbildung 2). Nach einem spürbaren Wandel im Widerstand gegen die Kapillare Einlegen, fließt der Liquor in die Kapillare.
7. Entfernen Sie vorsichtig die Kapillare, und verbinden Sie es mit einer 3 ml Spritze durch ein Polyethylen-Rohr, dass eine 1 mm Innendurchmesser hat. Spritzen Sie die CSF in eine pre-markierten 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen, und frieren das Rohr sofort auf Trockeneis und übertragen sie in eine -80 ° C Gefrierschrank.
8. Nach CSF Probenahme, die Muskeln werden neu ausgerichtet, und die Haut vernäht (4-0, Ethicon, Johnson & Johnson). Etwa 1 ml 0,9% NaCl subkutan zu de-Hydratation verhindern injiziert. Die Maus ist in den Inkubator gehalten, um die Körpertemperatur zu halten, bis es wieder, das Gewicht der Maus ist 1 Tag und 1 Woche nach der Operation überwacht.
Ergebnisse und Diskussion
Wir beschrieben eine sehr zuverlässige Protokoll für serielle Probenahme von CSF aus Mäusen ohne nachweisbare Plasma Kontamination.
1. Die ganze Prozedur dauert in der Regel 10 min pro Maus (einschließlich Narkose). Das Volumen der CSF erhalten ist abhängig von der Maus-Stämme. In der PS / APP doppelte Tg Mäusen benutzten wir 2, ist das durchschnittliche Volumen ca. 5 ul (3 bis 7 ul), während die P301L (JNPL3) Mäuse 3 geben eine Ausbeute von etwa 10 ul-15 ul. Für die serielle Probenahme, kann ein Maximum von 7-8 ul sicher genommen werden jedes Mal in einem Intervall von 2-3 Monaten.
2. Während der Operation ist es wichtig, den Kopf und den Körper der Maus richtig Stellung auf dem stereotaktischen Rahmen, so dass die Dura mater der Cisterna magna ausreichend belichtet werden können. Vermeiden Sie sorgfältig die Blutgefäße bei Eindringen in die Dura mater mit der Kapillare eine Verunreinigung von Plasmaproteinen, die in der CSF Probe durch Immunoblot für ApoB 4 überwacht werden verhindern können.
3. Die Minimierung der Gewebeschädigung bei jeder Operation ist wichtig, da Gewebe Verklebung der Schwierigkeit durch prädisponierende Blutungen für die nach der Probenahme erhöhen können.
4. Die Körpertemperatur muss auch während der Operation gewartet werden, weil Unterkühlung durch die Anästhesie verursachte wesentlich beeinflussen können das phosphorylierte Tau-Spiegel im Gehirn sehr schnell 5.
5. Die Ab ELISA-Protokoll und Antikörper, die wir verwendet wurden ausführlich in Refolo et al. 6. Zwei ul CSF aus dem PS / APP-Mäuse werden zufriedenstellende Ergebnisse bei einer Verdünnung von 1:50-1:60. Für die tau ELISA, ist 4-5 ul CSF aus P301L (JNPL3) Mäuse ausreichend für dieNachweis von Gesamt-Tau-oder Tau- Phosphor ylated an Threonin 231 (Kits sind aus Bio-Source gekauft).
6. Diese Technik kann auch auf andere Mausmodelle von neurologischen Erkrankungen, für die ein kleines Volumen von CSF ist zufriedenstellend für die gewünschten Tests angewendet werden.
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Discussion
Wir beschrieben eine sehr zuverlässige Protokoll für serielle Probenahme von CSF aus Mäusen ohne nachweisbare Plasma Kontamination.
1. Die ganze Prozedur dauert in der Regel 10 min pro Maus (einschließlich Narkose). Das Volumen der CSF erhalten ist abhängig von der Maus-Stämme. In der PS / APP doppelte Tg Mäusen wir Gebraucht2, ist das durchschnittliche Volumen ca. 5 ul (3 bis 7 ul), während die P301L (JNPL3) Mäuse 3 geben eine Ausbeute von etwa 10 ul-15 ul. Für die serielle Probenahme, kann ein Maximum von 7-8 ul sicher genommen werden jedes Mal in einem Intervall von 2-3 Monaten.
2. Während der Operation ist es wichtig, den Kopf und den Körper der Maus richtig Stellung auf dem stereotaktischen Rahmen, so dass die Dura mater der Cisterna magna ausreichend belichtet werden können. Vermeiden Sie sorgfältig die Blutgefäße beim Durchdringen der Dura mater mit der Kapillare eine Verunreinigung von Plasmaproteinen, die in der CSF Probe durch Immunoblot für ApoB 4 überwacht werden verhindern können.
3. Die Minimierung der Gewebeschädigung bei jeder Operation ist wichtig, da Gewebe Verklebung der Schwierigkeit durch prädisponierende Blutungen für die nach der Probenahme erhöhen können.
4. Die Körpertemperatur muss auch während der Operation gewartet werden, weil Unterkühlung durch die Anästhesie verursachte wesentlich beeinflussen können das phosphorylierte Tau-Spiegel im Gehirn sehr schnell 5.
5. Die Ab ELISA-Protokoll und Antikörper, die wir verwendet wurden ausführlich in Refolo et al. 6. Zwei ul CSF aus dem PS / APP-Mäuse werden zufriedenstellende Ergebnisse bei einer Verdünnung von 1:50-1:60. Für die tau ELISA, 4-5 ul CSF aus P301L (JNPL3) Mäuse ausreichend für den Nachweis von Gesamt-tau wird, oder tau am Threonin 231 phosphoryliert (Kits sind aus Bio-Source gekauft).
6. Diese Technik kann auch auf andere Mausmodelle von neurologischen Erkrankungen, für die ein kleines Volumen von CSF ist zufriedenstellend für die gewünschten Tests angewendet werden.
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Acknowledgments
Unsere Arbeit wird von NIH gewährt NS048447 und AG017216to KD unterstützt. Li Liu möchte Dr. Heikki Tanila (University of Kuopio, Kuopio, Finnland) für seine Betreuung und Unterstützung danken, während die Entwicklung der Original-Protokoll.
References
- Liu, L., et al. Longitudinal observation on CSF Abeta42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol Dis. 17, 516- (2004).
- Holcomb, L., et al. Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes. Nat Med. 4, 97 (1998).
- Lewis, J., et al. Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein. Nat Genet. 25, 402- (2000).
- DeMattos, R. B., et al. Plaque-associated disruption of CSF and plasma amyloid-beta (Abeta) equilibrium in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurochem. 81, 229 (2002).
- Planel, E., et al. Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia. J Neurosci. 27, 3090 (2007).
- Refolo, L. M., et al. A cholesterol-lowering drug reduces beta-amyloid pathology in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 8, 890 (2001).
