Isolamento e Cultura de Pós-Natal do rato Cerebelar Granule Células Progenitoras Neuron e Neurônios

Summary

Aqui apresentamos um método para isolar e cultivar células granulares do cerebelo e neurônio progenitor neurônios granulares do cerebelo de rato pós-natal.

Abstract

O córtex cerebelar é uma estrutura bem descrito que oferece oportunidades únicas para o estudo das propriedades neuronais e ^1,2 de desenvolvimento. Dos tipos cerebelar neuronal (células granulares, células de Purkinje e interneurônios inibitórios), neurônios granulares são de longe os mais numerosos e são o tipo mais abundante de neurônios no cérebro de mamíferos. Em roedores, os neurônios granulares do cerebelo são gerados durante as duas primeiras semanas pós-natal a partir de células progenitoras na camada mais externa do córtex cerebelar, a camada granular externa (EGL). O protocolo aqui apresentado descreve técnicas para enriquecer e neurônios granulares cultura e suas células progenitoras da pós-natal do cerebelo de rato. Iremos descrever os procedimentos para obter culturas de pureza aumentando ^{3,4, o} que pode ser usado para estudar a diferenciação de proliferação de células progenitoras em neurônios granulares ^5,6. Uma vez que as células progenitoras diferenciar, as culturas também proporcionam uma população homogênea de neurônios granulares para manipulação experimental e caracterização de fenômenos como a sinaptogênese, a função de receptor de glutamato ^7, interação com outras células purificadas cerebelar ^8,9 ou morte celular ^7.

Protocol

Parte 1: Configurando (1-2 dias antes da dissecção) (Não mostrado no vídeo)

1. Preparar soluções CULTURA E MEDIA:
   • 4X CMF-PBS-EDTA (cálcio e magnésio free-tampão fosfato salina-EDTA para diluições de Percoll): litro, adicione 32 g NaCl, 1,2 g KCl, 8 g de glicose, 2 g NaH ₂ PO _4, 1 g KH ₂ PO _4, 8 ml de 2% NaHCO stock _3, 10 ml 1M EDTA (pH 8,0) para água destilada / deionizada. Ajuste o volume para 1 litro eo pH para 7,4. Filtro de esterilizar.
   • HBSS GLUCOSE: Adicionar glucose (6 gramas / litro) para cálcio e magnésio da solução de Hank livre de sal Balance (HBSS) e filtro estéril. 500 ml pode ser armazenado a 4 ° C por até um mês.
   • Meios de cultura: sem soro médio (SFM) e 10% médio FBS. A 48 ml de Neurobasal A-Médio adicionar 500 mL 100X Glutamax I, 500 100X mL penicilina-estreptomicina (final 100 Unidades penicilina e estreptomicina 100 mg), 6,25 mL KCl 2 M (final 250 mM). Dividido em duas alíquotas de 9 ml e 40 ml. Para preparar 10% de médio FBS, adicionar 1 ml de inativado pelo calor FBS à alíquota de 9 ml. Para preparar SFM, adicionar 800 mL do suplemento sem soro B-27 à alíquota de 40 ml. Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C para um máximo de duas semanas. Para melhores resultados fazer novas mídias para cada experimento.
2. Preparar diluições PERCOLL:
   • Percoll é fornecido como um líquido e deve ser acidificado antes de usar. Para preparar o estoque, adicionar HCl 1N, pouco a pouco para a solução Percoll durante um período de 1-2 horas até que o pH 7,4 é atingido. Adicionando o HCl muito rapidamente fará com que o Percoll para agregar. Cerca de 6.5ml de 1N HCl são necessários para cada litro de Percoll. Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C.
   • A 35% e 60% (vol: vol) diluição Percoll será utilizado na etapa de gradiente de Percoll. Preparar 100 ml Percoll diluições contendo 35 ou 60 ml de Percoll estoque, 25 ml de 4X CMF-PBS-EDTA e água destilada / deionizada H2O ao volume final. Adicione algumas gotas de azul de toluidina para a solução de 60%, ele vai ajudar a visualizar a interface e as células. Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C.
   • 4X CMF-PBS-EDTA não deve ser mais de 3 meses, como buffer inadequada causará a morte celular aumentou durante o procedimento.
3. Lamelas PREPARAÇÃO: lamínulas de vidro (melhor se de Carolina Supply Company Biológicas) são lavados com HCl 10% durante a noite a temperatura ambiente com agitação leve, enxaguar bem com água destilada / deonized água e armazenadas em etanol 70%. Antes do uso, lamínulas simples são chama-esterilizados por breves instantes, segurando-os com uma pinça sobre uma flama aberta (bico de Bunsen), até a evaporação do etanol. Lamínulas de 12 mm de vidro podem ser colocadas em placas de quatro bem-cultura e de 25 mm lamínulas em placas de 6 poços cultura.
4. NAVIOS DE REVESTIMENTO DE SUBSTRATO COM CULTURA: Para imunofluorescência ou lamelas de drogas tratamentos de vidro são mais adequadas, pois podem ser facilmente montados em lâminas de vidro para visualização sob um microscópio. Quando um grande número de células necessárias para a recolha de amostras de proteína ou RNA, as células podem ser cultivadas em cultura de plástico noite dishes.The antes da dissecação, lamínulas de vidro ou pratos de plástico para a cultura devem ser revestidos com poli-D-lisina (500 mg / ml; 800 mL / poço de 6-lamelas ou 350 mL / poço para 4 bem-chapas). 5 mg / ml solução estoque de poli-D-lisina é armazenada a -20 ° C, em seguida, diluídos em água destilada / deonized estéril e direito estéril filtrado antes do uso. Embarcações de cultura são incubados a 37 ° C durante a noite (ou pelo menos por 2 horas antes do plaqueamento) e lavadas duas vezes com direito a água destilada estéril / deonized antes do plaqueamento.
5. Preparar pratos PREPLATING: Estes pratos serão utilizados para a pré-revestimento de células isoladas do cerebelo diante da cultura para remover os contaminantes da glia, que aderem mais facilmente a uma menor concentração de substrato. Revestimento dois de 60 mm de plástico placas de cultura com 4 ml por prato de poli-D-lisina (100 mg / ml; Note que este é 1 / 5 da concentração utilizada para cultura). Incubar a 37 ° C durante a noite (ou pelo menos por 2 horas antes da dissecção). Logo antes da dissecção, remover a solução de poli-D-lisina, lavar a louça duas vezes com água estéril e deixar secar no capô.
6. Esterilizar instrumentos de dissecação em autoclave ou no dia da dissecção, mergulhe as ferramentas em etanol 70% por 20 minutos. Ferramentas necessárias: uma tesoura Permaset, tesoura microdissecting, quatro Dumont # 5 pinças de dissecação.

Parte 2: Preparando-se para dissecção (dia de dissecção) - (demonstrado em vídeo)

Todos os seguintes procedimentos são realizados em uma capa de cultura de tecidos, a menos que observou.

1. Limpe a área de dissecação com etanol 70%. Aquecer a mídia para 37 ° C em banho-maria ou em um 5% CO ₂ 37 ° C incubadora.
2. Ao criar um novo sistema de papaína dissociação Kit (Worthington), preparar a solução de albumina-ovomucoid inibidor. Adicionar 32 mlde EBSS (solução salina balanceada de Earle, fornecido no kit) para a mistura de inibidor de albumina ovomucoid e permitir que o conteúdo para dissolver enquanto prepara os outros componentes. Reconstituir para o primeiro uso, em seguida, armazenar o restante solução a 2-8 ° C e seu uso até os cinco isolamentos permitido por cada kit estão concluídas.
3. Adicionar 5 ml de EBSS para um frasco papaína do Kit dissociação (cada frasco é suficiente para a dissociação de 4-15 cerebelos de ratos pós-natais dia 5). Coloque o frasco papaína em 5% de CO ₂ 37 ° C incubadora ou 37 ° C banho-maria por 5 a 10 minutos até que a papaína é completamente dissolvido ea solução aparece clara. Manter a solução em temperatura ambiente durante a dissecção.
4. Adicionar 500 mL de EBSS para um frasco DNase do Kit dissociação. Misture delicadamente tocando no frasco desde DNase é sensível a desnaturação de cisalhamento. Adicionar 250 mL desta solução para o frasco contendo a papaína (concentração final é de 20 unidades / ml papaína e DNase 0,005%). Salve o frasco DNase restante para utilização na etapa 5.1 ou 6.1.

Parte 3: Dissecção e remoção Meninges

1. A idade ideal para a cultura de células de grânulos de camundongos C57BL/6J é dia pós-natal 4-6, quando o número de células progenitoras grânulo na EGL peaks1, 10. Dissecar filhotes de cada vez e como você se torna mais familiarizado com a dissecção cerebelar tentar reduzir o tempo de dissecação para não mais de 6 minutos por filhote. Velocidade é da essência.
   Se o passo gradiente Percoll é ignorada, oito filhotes dias pós-natal do rato-5 pode produzir células suficientes para uma placa de cultura de 6 poços (ou seis de 25 mm lamelas) ou por seis pratos quatro bem-cultura (ou 24 12 - lamínulas mm). Rendimento aproximado é de 4 a 5x106 células por densidades das crias e revestimento pode variar entre 1 e 5X105 cells/cm2. Como as células de 15-20% são perdidos durante o step4 Percoll, mais animais são necessários para obter a densidade mesma célula desejada.
2. Pipetar 15 ml de HBSS glicose em uma placa de cultura de 60 mm de plástico e tecido 10 ml em uma estéril 15 ml Falcon tubo plástico cônico. Coloque sobre o gelo.
3. Fora a capa, limpe a cabeça do cachorro com etanol 70%. Use uma tesoura Permaset para decapitar o filhote. (Decapitação não será mostrado no vídeo.)
4. No bairro, segure a cabeça com uma pinça Dumont para que você possa ver claramente a parte de trás do crânio. Acesso ao cérebro através da inserção de uma tesoura microdissecting no forame magno e corte reto em direção aos olhos. Utilizando uma pinça, descascar a pele e levante a caveira para expor o cérebro. Utilizando uma pinça Dumont, belisque o cerebelo eo mesencéfalo circundante e transferi-lo para o prato com HBSS glicose. (É mais fácil manipular o cerebelo e remover as meninges se o cerebelo é ainda ligado ao tecido circunvizinho).
5. Sob o microscópio de dissecação, descascar delicadamente as meninges fora do cerebelo e também entre os lobos com uma fina Dumont # 5 forceps durante o uso do fórceps, inseri-baixo do cerebelo para a chapa. Você vai notar vasos sanguíneos na superfície do cerebelo. Estes vasos sanguíneos são uma boa maneira de identificar as meninges. Remove as meninges até o cerebelo assume uma aparência branca emaranhada. Separar o cerebelo do resto do mesencéfalo. Ligá-lo ao seu lado ventral e remover o plexo coróide, que se parece com uma fita vermelha entre o cerebelo e mesencéfalo ventral adjacente. Coloque cada cerebelo no frio HBSS glicose em um tubo de 15 ml cônico no gelo logo dissecado. Mudar a solução de dissecação a fresco HBSS glicose após dissecar três cérebros.

Parte 4: suspensão de células

1. Depois de todas as dissecções terminar, remova o HBSS glicose do tubo e substituí-lo com a solução de papaína feita no passo 2.4. Embora o kit recomenda cortar o tecido em pedaços pequenos, descobrimos que não é necessário cortar ou picar o cerebelos nesta idade. Coloque o tecido solução papaína + (em um tubo cônico de 15 ml) a 37 ° C banho-maria ou 5% de CO ₂ 37 ° C incubadora por 15 a 20 minutos. Para 4-8 cerebelos, 15 minutos a 37 ° C é suficiente, pois um número maior de cerebelos 20 a 30 minutos é melhor. Agite suavemente o tubo a cada 3 a 4 minutos.
2. Triturar a mistura com uma ponta de pipeta estéril p1000 aerossol que foi revestido com FBS. Fazer este passo com cuidado para evitar qualquer formação de bolhas de ar. Pipetas de vidro polido fogo pode ser usado, mas nós achamos que o soro revestido estéril p1000 dicas aerosol funcionar tão bem. Para revestir a ponta da pipeta com FBS, pipeta FBS cima e para baixo duas vezes imediatamente antes da utilização. Cerca de 10 movimentos para cima e para baixo com a pipeta é suficiente para dissociar o tecido. A solução irá tornar-se turva. Permitir a suspensão para se sentar durante 30-60 segundos, para que todos os pedaços grandes de tecido não dissociado vai assentar no fundo do tubo.
3. Remover as células em suspensão (cuidado para não remover os pedaços de tecido não dissociado na bottom) em um novo tubo de 15 ml com uma ponteira de soro revestido. Centrifugar a aproximadamente 200xg por 5 minutos em temperatura ambiente. Prepare re-suspensão médio. Para fazer isso, misturar 2,7 ml EBSS com 300 ml de solução reconstituída inibidor albumina ovomucoid em um tubo estéril. Adicionar 150 ml de solução DNase a partir do passo 2.4.
4. Após a centrifugação, desprezar o sobrenadante e ressuspender imediatamente o pellet celular na DNase diluído / solução inibidora de albumina preparada no passo 4.3 com um soro revestido p1000 aerosol pipeta ponta.
5. Prepare um gradiente de densidade descontínua como se segue. Adicionar 5 ml de albumina-ovomucoid solução inibidora para um tubo de 15 ml. Cuidadosamente camada de suspensão da célula na parte superior. Centrifugar a aproximadamente 70xg por 6 minutos em temperatura ambiente. Células dissociadas pellet no fundo do tubo, fragmentos de membrana permanecer na interface.
6. Se você deseja obter culturas que são ricos em células granulares, ignorar o Percoll etapa de separação de gradiente (que produz culturas puras de células granulares do cerebelo), e prosseguir para a Parte 6. Se você deseja isolar ainda mais as células grânulo da glia e interneurônios grande por separação por gradiente de Percoll, vá para a Parte 5. Uso do gradiente de Percoll passo vai reduzir o rendimento das células. Em nossas mãos, a redução no rendimento é de aproximadamente 20-35%. No entanto, há um aumento no enriquecimento de neurônios granulares e células progenitoras de cerca de 90% para 95-99%.

Parte 5: Separação Gradiente de Percoll

1. Desprezar o sobrenadante e imediatamente ressuspender o sedimento em 2 ml de HBSS glicose com 50 ul de DNase a partir do passo 2.4. Filtrar a suspensão de células através de uma malha de nylon (tamanho dos poros 70 mm) pela gravidade. Esta etapa irá remover grandes células não-neuronais e prevê uma suspensão melhor única célula.
2. Prepare-fogo duas pipetas de vidro polido Pasteur. Para fazer isso, gentilmente chama a ponta de uma pipeta de vidro até a borda é alisado eo levou pipeta é de 40-50% do tamanho original. Tome cuidado para não fazer a abertura muito pequena.
3. Prepare gradiente de Percoll. Coloque 10 ml de solução de Percoll 35% em um tubo estéril 50 ml. Percoll 60% (10 ml) é carregado para uma seringa de 10 ml estéril com uma agulha estéril espinhal anexado. Suavemente a camada de solução de Percoll 60% abaixo da solução de 35%, adicionando a solução de 60% no fundo do tubo com a agulha espinhal. Tome o cuidado de manter uma interface nítida entre as duas camadas. Adicionar as células para o topo do gradiente utilizando uma pipeta-fogo polido, adicionando-os delicadamente ao longo do lado do tubo, sem perturbar a interface.
4. Coloque cuidadosamente o tubo na centrífuga e centrifugar a 1800xg. Rampa até a velocidade de um passo a cada 20 segundos (incrementos de velocidade são as seguintes: aproximadamente 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg) para que ele leva cerca de 2 minutos para chegar à velocidade desejada. Iniciar o temporizador de 10 min, quando 1800xg é atingido. Quando terminar, diminua a velocidade gradualmente um passo a cada 20 segundos.
5. Remover a interface superior do gradiente (contendo glia grande, células de Purkinje, e interneurônios) e descarte.
6. Remova cuidadosamente as células na interface entre os 35% e Percoll 60%, com uma pipeta-fogo polido e transferir para um tubo de 50 ml. Ressuspender em 3 volumes de HBSS glicose e misturar por inversão várias vezes. Centrifugar durante 5 minutos a 1100xg.
7. Remover o sobrenadante e adicionar 4 ml de 10% FBS médio com 50 ul de DNase. Ressuspender o sedimento delicadamente com uma pipeta-fogo polido para formar uma suspensão única célula. Avance para o passo 6.2.

Parte 6: Pré-plating e Galvanização

1. Desprezar o sobrenadante e imediatamente ressuspender o sedimento em 4 ml de 10% FBS médio com 50 ul de DNase a partir do passo 2.4. Filtrar a suspensão de células através de uma malha de nylon (tamanho dos poros 70 mm) pela gravidade. Esta etapa irá remover grandes células não-neuronais e prevê uma suspensão melhor única célula.
2. A placa de células coletadas em um poli-D-lisina prato pré-plating revestido por 20 minutos em 5% de CO ₂ 37 ° C incubadora. Repita com um prato de doce. As células astroglia e mais pesado vai sossegar e aderir aos pratos e deixar os neurônios de grânulos pequenos e células progenitoras neurônio flutuante. Após a incubação, os neurônios granulares frouxamente aderido e células progenitoras neuronais são facilmente desmontáveis ​​e afrouxou com toque suave do prato.
3. Recolher os neurônios granulares e células progenitoras neurônio em um tubo cônico de 15 ml e centrifugar a 200xg por 5 minutos. Ressuspender o sedimento em 1 ml de soro livre de médio e contar uma alíquota de 10 ml utilizando um hemocitômetro.
4. Adicionar soro livre de meio para alcançar a densidade de célula desejada. Directrizes gerais para números de células para a chapa de média densidade: por 6 bem-pratos, 3,5-4000000 células; para placas de quatro poços, 650.000 células. Para 6-bem placas de cultura, eu placa 1,5 ml / poço e para 4 bem-plates, eu chapa de 0,5 ml / poço. As células são mantidas em 5% de CO ₂ 37 ° C incubadora. Mudar o meio completamente 24 horas mais tarde, com alterações posteriores a cada dois ou três dias.

Discussion

Este protocolo é baseado em modificações de procedimentos que têm sido descritos na ^3,7,11 passado. Há vários pontos importantes a considerar como discutido abaixo.

Os neurônios granulares e células progenitoras aderir dentro de 2 horas de placas. Células saudáveis ​​têm uma morfologia redonda sob o microscópio de contraste de fase ^4. Dentro de 24 horas após o plaqueamento, as células saudáveis ​​vai se espalhar uniformemente ao redor as lamelas ou o bem de plástico e formarão processos. Na época da mudança média em primeiro lugar, depois de 24 horas, haverá algumas células mortas flutuante. Isso é normal, como algumas células vão morrer ou tornar-se saudável durante o processo de dissociação. No entanto, se após 48 horas as células são aglutinados com varicosidades em seus processos, tanto as células são insalubres ou o substrato poli-D-lisina é tóxico. Como a maioria dos substratos, a eficácia de poli-D-lisina é muito dependente e cada novo lote deve ser testado. Imagens de culturas saudáveis ​​podem ser encontrados nas referências ^{4,11 e 20.} Células saudáveis ​​podem ser mantidas em cultura por até duas semanas ^8.

Progenitores neurônio grânulos começam a se diferenciar em cima plating ^8,12,13,14. Uma vez que a densidade ideal chapeamento é estabelecida para os seus estudos, deve ser mantida, porque a proliferação é promovido por fatores como a sinalização Notch ^15, e as células se proliferam mais em densidades mais altas. A proliferação de progenitores grânulo neurônio pode ser substancialmente prolongado adicionando sonic hedgehog (Shh) para o meio ^12,13,14. Laminina também pode ser adicionado como um substrato, além de poli-D-lisina para promover a neurite conseqüência ^16,17. Estas características da cultura de células grânulo oferecer um sistema para estudar tanto a biologia dos neurônios granulares ou a regulação da diferenciação das células progenitoras em neurônios ^6,18,19.

Isolaram células cerebelares de ratos pós-natais são inicialmente composta por uma mistura de grânulos de neurônios e células progenitoras grânulo neurônio em diferentes estágios do ciclo celular ^8. Há também astroglia e interneurônios presentes no isolamento / cultura e purificação adicional de neurônios granulares e progenitores grânulo (95% -99%) é obtido pelo gradiente de Percoll ^quatro separação. Células granulares enriquecido obtido sem a utilização da etapa de separação por gradiente de Percoll foram usados ​​para estudar a regulação da proliferação e diferenciação de progenitores grânulo neurônio, ^18,19,20. Corroborando a isso, nós achamos que as células na população isolada ignorando o Percoll passo separação por gradiente de responder robustamente para Shh, permanecendo no ciclo celular por vários dias, e que sem adição Shh, há muito pouco a proliferação nas culturas, conforme indicado através da coloração com a fabricante de proliferação celular, Ki67. No entanto, se as culturas devem ser utilizados para além de vários dias in vitro, recomenda-se que o passo do gradiente Percoll ser incluídos para diminuir a contaminação dos neurônios granulares pela proliferação células não-neuronais.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell strainer with 70μm mesh pore	BD Biosciences	352350
Spinal Needle	BD Biosciences	405182	20G x 3-1/2 inches
Poly-D-Lysine mol wt>300,000	Sigma-Aldrich	P1024	Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested.
Percoll	Sigma-Aldrich	P-1644
Penicillin-Streptomycin (100X)	Sigma-Aldrich	P4333
HBSS	Invitrogen	14175-103	Must be calcium and magnesium free.
Neurobasal A-Medium	Invitrogen	10888-022
Glutamax I supplement	Invitrogen	35050-061
B-27 Serum Free Supplement (50x)	Invitrogen	17504-044
12-mm circle coverslips	Carolina Biological	63-3029	These are made in Germany by Deckgluder.
25-mm circle coverslips	Carolina Biological	63-3037	These are made in Germany by Deckgluder.
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical	LK 003150	Kit is good for five isolations.
Permaset scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS6782
Dumont #5 (Dumostar)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS4978
4-well culture dish	Nalge Nunc international	176740
6-well culture dish	Nalge Nunc international	140685