Summary
ここでは、出生後のマウスから小脳顆粒ニューロン前駆細胞や小脳顆粒ニューロンを分離して培養する方法を提示する。
Abstract
小脳皮質は神経細胞の特性と開発の1,2を研究するためのユニークな機会を提供するだけでなく説明する構造です。小脳ニューロンタイプ（顆粒細胞、プルキンエ細胞と抑制性介在）のうち、顆粒ニューロンは、これまでで最も多数あり、哺乳類の脳における神経細胞の中で最も豊富なタイプです。げっ歯類では、小脳顆粒ニューロンは小脳皮質、外顆粒層（EGL）の最外層の前駆細胞からの最初の二つの出生後の数週間の間に生成されます。ここで紹介するプロトコールは、豊かにする技術と文化の顆粒ニューロンと出生後のマウスの小脳からそれらの前駆細胞を説明します。我々は、顆粒ニューロン5,6に前駆細胞の増殖分化を研究するために使用することができます増やす純度3,4の文化を、取得する手順を説明します。一度前駆細胞が分化、文化はまた、シナプス形成、グルタミン酸受容体の機能7、他の精製された小脳細胞8,9または細胞死7との相互作用などの現象の実験的操作と特性評価のための顆粒神経細胞の均質な集団を提供しています。
Protocol
パート1：（ビデオで示されていません）（解剖前に1〜2日）の設定
- 培養液とメディアを準備：
- 4X CMF - PBS - EDTA（パーコールの希釈のためのカルシウムとマグネシウムのフリーリン酸緩衝生理食塩水- EDTA）：リットルは、32グラムのNaCl、1.2グラムのKCl、8 gのグルコース、2グラムのNaH 2 PO 4、1gのKH 2 POを追加する4、8 mLの2％のNaHCO 3の株式、脱イオン/蒸留水に10ミリリットル1MのEDTA（pH8.0）。 1リットルと7.4のpHに音量を調整します。滅菌フィルタします。
- HBSS -グルコース：カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクスバランス塩溶液（HBSS）および滅菌フィルターにグルコース（6グラム/リットル）を追加。 500mlを、最大ヶ月間4℃で保存することができる。
- 培養培地：無血清培地（SFM）および10％FBS培地。 Neurobasal A -培地48 mlに500μlの100Xグルタミン私、500μlの100Xペニシリン - ストレプトマイシン（最終の100単位のペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン）、6.25μlの2 M KClを（250、最終μM）に追加します。 9ミリリットルの2アリコートと40mlの分割。 10％FBS培地を準備するには、9 mlのアリコートに熱不活化FBSの1mlを加える。 SFMを準備するには、40mlのアリコートに無血清サプリメントB - 27の800μlを加える。滅菌濾過し、2週間の最大のために4℃で保存します。最良の結果がそれぞれの実験のために新鮮な培地を作るために。
- パーコール希釈の準備：
- パーコールは液体として供給され、それは使用前に酸性化する必要があります。 pHが7.4に達するまで株式を準備するには、1〜2時間の期間にわたってパーコールソリューションに少しで1N塩酸を少し追加。あまりにも急速にHClを添加すると、集計にパーコールが発生します。 1N塩酸の約6.5ミリリットルはパーコールの各リットル必要とされる。滅菌濾過し、4℃で保存します。
- 35％、60％（体積：体積）パーコールの希釈は、Percoll勾配のステップで使用されます。 、パーコール株式の35または60 mlを入れた100ミリリットルパーコールの希釈液を調製4X CMF - PBS - EDTA及び蒸留25mlの/最後のボリュームにH2O脱イオン水。 60％のソリューションに青トルイジンの数滴を追加し、それはインタフェースと細胞を視覚化するのに役立ちます。滅菌濾過し、4℃で保存します。
- 不十分なバッファリングが手順の実行中に増加し、細胞死の原因となるので、4X CMF - PBS - EDTAは、3ヶ月以上経過であってはならない。
- はPREPARINGカバーガラス：ガラスカバースリップは、（最高のキャロライナ生物供給会社からの場合）、軽く攪拌しながら室温で一晩10％塩酸で洗浄deonized /蒸留水で十分にすすぎ、70％エタノールに格納されています。ご使用の前に、単一のカバースリップは火炎滅菌簡単にエタノールが蒸発するまで、裸火（ブンゼンバーナー）を介して鉗子でそれらを保持することによって。 12 mmのガラス製カバースリップを6ウェル培養プレートの4ウェル培養プレートと25 mmのカバースリップに配置することができます。
- 基板とのコーティングの培養容器：それらは簡単に顕微鏡下で可視化するためのガラススライドにマウントすることができるので、免疫蛍光染色または薬物治療ガラス製カバースリップの方が適しています。 、文化のための解剖、ガラス製カバースリップまたはプラスチック製の皿が（500μg/ mlのポリ- D -リジンでコーティングされている必要があります前に、多数の細胞が蛋白質またはRNAサンプルを収集するために必要とされている場合、セルはプラスチック製の培養上dishes.The夜を培養することができます。 μL/ウェル、6ウェルプレートで800または350μl/ウェル、4ウェルプレート用）。 5 mgの/ポリ- D -リジンのmlのストック溶液は-20 ° C、その後、滅菌deonized /蒸留水及び使用前に滅菌濾過右に希釈に格納されています。培養容器は、（メッキ前または少なくとも2時間用）37℃で一晩インキュベートし、メッキ前に滅菌蒸留/ deonized水の右で2回洗浄する。
- PREPLATING皿を準備：これらの料理は、基板の低濃度に、より容易に付着するグリア汚染物質を除去するために文化の前に分離された小脳の細胞をあらかじめめっきに使用されます。コートポリ- D -リジンの皿あたり4ミリリットル（100μg/ mlの、これは培養に使用される濃度の1 / 5です注）と2つの60 mmのプラスチック培養皿。 （または、少なくとも解剖前に2時間用）37℃で一晩インキュベートする。右解剖前に、滅菌水で二回皿を洗うとフードで乾燥させるため、ポリ- D -リジン溶液を取り除く。
- オートクレーブや解剖の日に解剖ツールを殺菌、20分間70％エタノールでツールを浸す。必要なツール：Permasetはさみ、microdissectingはさみ、4デュモン第5位解剖鉗子。
パート2：解剖（解剖の日）の準備 - （ビデオで示される）
断りのない限り次の手順のすべては、組織培養フードで実行されます。
- 70％エタノールで解剖エリアを拭う。 ℃の水浴中でまたは5％CO 2、37℃インキュベーターで37メディアを温める。
- 新しいパパイン解離システムキット（ワーシントン）起動時には、アルブミン、オボムコイド阻害剤の溶液を調製。 32ミリリットルを追加します。EBSS（アールの平衡塩類溶液、キットに付属）のアルブミン - オボムコイド阻害剤の混合物へと他のコンポーネントを準備中に内容が溶解することができます。最初の使用のための再構成、そして℃で2-8で残りの溶液を格納し、各キットによって許可fiveアイソレーションが完了するまで使用してください。
- 解離キット（各バイアルは、生後5日目マウスの4から15小脳の解離のために十分である）から一パパインのバイアルにEBSS 5 mlを加える。パパインが完全に溶解し、溶液が透明に表示されるまで、5％CO 2、37℃インキュベーターまたは37 5〜10分間℃の水浴中にパパインバイアルを置きます。解剖時の室温でのソリューションを維持する。
- 解離キットから一つのDNaseバイアルにEBSS 500μlを添加します。 DNaseはせん断変性に敏感であるため、バイアルをタップすることで静かに混和。パパイン（終濃度20単位/ mlパパイン、0.005％DNase処理である）を含むバイアルに、このソリューションの250μlを追加します。ステップ5.1または6.1で使用するために残りのDNaseバイアルを保存します。
パート3：解剖と髄膜の除去
- C57BL/6Jマウスから顆粒細胞培養のための最適な年齢は生後4-6、EGL peaks1、10の顆粒細胞の前駆細胞の数。です。子犬を一度に1つずつ細かく分析し、小脳解剖子犬あたり1 6より分に解剖の時間を短縮しようとすると慣れてくると。速度は非常に重要である。
Percoll勾配のステップがバイパスされている場合、8つの生後日 - 5仔マウスは、1つの6穴培養プレート（または6 25mmのカバースリップ）または6つの4 - ウェル培養プレート（または24 12の十分な細胞を得ることができます - mmのカバーガラス）。おおよその収率は、子犬とメッキ密度あたり4〜5x106細胞がcells/cm2 1〜5X105の範囲が可能です。 15〜20％の細胞はパーコールステップ4中に失われているので、より多くの動物が同じ所望の細胞密度を得るために必要とされる。 - ピペット滅菌ファルコン15 mlコニカルプラスチックのチューブに60 mmのプラスチック製組織培養皿と10 mlのHBSS -グルコース15mlの。氷上に置く。
- フードの外側に、70％エタノールで子犬の頭を拭いてください。子犬の首を切るためにPermasetのはさみを使用してください。 （断頭は、ビデオには表示されません。）
- フードでは、あなたが明らかに頭蓋骨の背面を見ることができるようデュモンの鉗子で頭をホールド。大後頭孔にmicrodissectingはさみを挿入し、目に向かってまっすぐにカットすることで脳にアクセスします。皮離れて鉗子、スキンを使用して、脳を露出するために頭蓋骨を持ち上げる。デュモンの鉗子を用いて、小脳とその周辺の中脳をピンチオフし、HBSS -グルコースで皿に移す。 （これは、小脳を操作し、小脳がまだ周囲の組織に接続されている場合は髄膜を除去する方が簡単です）。
- 解剖顕微鏡下で、静かに小脳から髄膜皮とまたプレートに小脳を固定するために他の鉗子を使用しながら、ある晴れたデュモン第5ピンセットで葉の間。あなたは、小脳の表面に血管がわかります。これらの血管は、髄膜を識別するための良い方法です。小脳はマットホワイト外観を取るまで、髄膜を取り外します。中脳の残りの部分から小脳を区切ります。その腹側にそれを回し、腹側小脳と隣接する中脳の間に赤のリボンのような脈絡叢を、削除してください。早く解剖と氷上で15 mlのコニカルチューブに冷HBSS -グルコースの各小脳を置きます。 3脳を解剖した後新鮮なHBSS -グルコースに解剖ソリューションを変更します。
パート4：細胞懸濁液
- 一度すべての解剖が終了している、チューブからHBSS -グルコースを除去し、ステップ2.4で作成したパパイン溶液と交換してください。このキットは小さな断片に組織を切断推奨していますが、我々はそれがこの歳で小脳をカットしたりミンチする必要がないことがわかります。 37℃の水浴または、5％CO 2 37 15〜20分間℃のインキュベーターで組織+パパイン溶液（15 mlコニカルチューブに）置きます。 4〜8小脳、37℃で15分間° Cで十分です。小脳、20〜30分の大きい数のために優れています。ゆっくりとチューブごとに3〜4分に撹拌。
- FBSでコーティングされている滅菌P1000エアロゾルのピペットチップとの混合物を砕いて粉にする。どんな空気の気泡の形成を防ぐために穏やかに、この手順を実行してください。火災研磨したガラスピペットが使用されていますが、我々は血清コーティングされた無菌P1000エアロゾルのヒントが同様に作用することに気付くことができます。二回使用直前に上下コートFBSとピペットチップ、ピペットFBSをに。ピペットで最大10程度とダウンの動きは、組織を解離するのに十分です。溶液は濁りになります。サスペンションは非常に解離していない組織の任意の大部分は、チューブの底に沈降することを30〜60秒間座ってすることができます。
- Bで解離していない組織片を削除しないように注意して浮遊細胞を（削除する血清コーティングされたピペットチップで新鮮な15 mlコニカルチューブにottom）。室温で5分間、約200xgで遠心分離します。再懸濁培地を準備します。これを行うには、滅菌チューブに再構成されたアルブミン-オボムコイド阻害剤溶液300μlで2.7ミリリットルEBSSを混ぜる。ステップ2.4からDNase溶液150μlを加え。
- 遠心分離後、上清を廃棄し、すぐに血清コーティングP1000のエアロゾルピペットの先端で、ステップ4.3で作成した希薄化後のDNase /アルブミン阻害剤溶液で細胞ペレットを再懸濁します。
- 次のように不連続密度勾配を準備します。 15 mlコニカルチューブにアルブミン-オボムコイド阻害剤溶液5mlを追加。上に注意深く層細胞懸濁液。室温で6分間、約70xg間遠心する。チューブの下部に解離細胞ペレットは、膜断片は、インタフェースのまま。
- あなたが顆粒細胞に富む文化を取得したい場合は、Percoll勾配分離ステップを（小脳顆粒細胞の純粋な文化を表します）バイパス、およびパート6に進みます。あなたがさらにPercoll勾配分離によってグリアと大型介在から顆粒細胞を分離したい場合は、パート5に進みます。 Percoll勾配のステップの使用は、細胞の収率が低下します。私たちの手では、収量の減少は約20から35パーセントです。しかし、約90％から95〜99％の顆粒神経細胞と前駆細胞の濃縮の増加がある。
パート5：Percoll勾配分離
- 上清を捨て、すぐにステップ2.4からのDNase50μlをHBSS -グルコース2mlにペレットを再懸濁します。重力によるナイロンメッシュ（孔径70μm以下）も、細胞懸濁液をフィルターします。このステップでは、大規模な非神経細胞を除去し、よりよい単一の細胞懸濁液のために提供されます。
- twoファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを準備します。これを行うには、静かに炎ガラスピペットの先端をエッジが平滑化されるまでとピペットボアは元のサイズの40〜50％です。開口部が小さすぎるように注意してください。
- Percoll勾配を準備します。 50ミリリットル滅菌コニカルチューブに35％パーコール溶液の代わりに10ミリリットル。 60％パーコール（10ml）を添付滅菌脊髄針、10 mlの滅菌注射器にロードされます。脊髄針とチューブの底に60％溶液を加えて35重量％溶液を下にそっと層60％パーコールのソリューションを、。 2つの層の間のシャープな界面を維持するように注意してください。優しくインタフェースを妨げることなく、チューブの側面に沿ってそれらを追加、ファイアーポリッシュピペットを用いて勾配の上部にセルを追加します。
- 1800xgで遠心し、遠心でチューブを静かに置きます。それが目的の速度に達するまで約2分かかるように：スピード一歩ごとに20秒（約18、70、200、440、850、1100、1800xg速度の増分は次の通りです）に上昇。 1800xgに達すると10分にタイマーを開始します。終了したら、徐々に一歩ごとに20秒を短縮減少。
- グラデーションの左上インタフェースを（大グリア細胞、プルキンエ細胞、及び介在を含む）を取り外して廃棄します。
- 慎重にファイアーポリッシュピペット及び50 mlコニカルチューブに移すと35％、60％パーコールの間のインターフェイスでセルを削除します。反転数回でHBSS -グルコースとミックスの3倍量に再懸濁します。 1100xgで5分間遠心分離します。
- 上清を除去し、DNase50μlと10％FBS培地を4 ml加える。穏やかに、単一の細胞懸濁液を形成するためにファイアーポリッシュピペットを用いてペレットを再懸濁します。 6.2に進みます。
第6部：プレめっきおよびめっき
- 上清を捨て、すぐにステップ2.4からのDNase50μlの10％FBS培地4 mlにペレットを再懸濁します。重力によるナイロンメッシュ（孔径70μm以下）も、細胞懸濁液をフィルターします。このステップでは、大規模な非神経細胞を除去し、よりよい単一の細胞懸濁液のために提供されます。
- プレートを5％CO 2、37℃インキュベーターで20分間ポリ- D -リジンコートしたプレメッキ皿上に回収した細胞。新鮮な料理を繰り返します。アストログリアと重い細胞が落ち着くと皿に付着し、小さな顆粒ニューロンとニューロンの前駆細胞をフローティング状態のままになります。インキュベーション後、ゆるく付着した顆粒ニューロンとニューロンの前駆細胞が簡単に外れているとプレートの穏やかなタッピングをほぐした。
- 5分間200xgで15 mlコニカルチューブと遠心分離機の顆粒ニューロンとニューロンの前駆細胞を収集する。無血清培地1mlにペレットを再懸濁し、血球計算盤を用いて10μlのアリコートを数える。
- 所望の細胞密度に到達する無血清培地を追加。中密度のためのプレートに細胞数の大まかなガイドライン：6ウェルプレート、3.5から4000000セル用、4ウェルプレート用、65万細胞。 6ウェル培養プレートのため、私はプレート1.5ミリリットル/ウェル、4のためのよくPLATESは、私プレートを0.5ml /よく。細胞は、5％CO 2、37℃インキュベーター中で維持されます。後続の変更毎に2〜3日と24時間後に完全に培養液を交換する。
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Discussion
このプロトコルは、過去3,7,11に記載されている手順の変更に基づいています。以下に述べるように注意することは、いくつかの重要な点があります。
顆粒ニューロンおよび前駆細胞は、メッキの2時間以内に従っている。健康な細胞は位相差顕微鏡の4の下にある丸い形態を持っている。メッキ後24時間以内に、健康な細胞はカバースリップまたはプラスチック製のよく周りに均等に広がっていくとプロセスを形成します。第1の媒質の変化の時に、24時間後に、いくつかの死んだ浮遊細胞が存在します。これは、少数の細胞が死ぬか、解離の過程で不健康になるので、正常です。 48時間後の細胞はそれらのプロセスに対してvaricositiesと一緒に凝集している場合は、、細胞が不健康であるか、またはポリ- D -リジン基質は毒性がありますどちらか。ほとんどの基板と同様に、ポリ- D -リジンの有効性は多くの依存しており、それぞれの新しいロットをテストする必要があります。健全な文化のイメージが参照4,11、および20に見つけることができます。最大2週間〜8のために健康な細胞を培養で維持することができます。
顆粒ニューロン前駆細胞は、メッキ8,12,13,14時に区別し始める。最適な播種密度は、あなたの研究のために確立されると増殖がそのようなNotchシグナル15などの要因によって促進され、そして細胞が高い密度でより多くを増殖するので、それは、維持されるべきである。顆粒ニューロン前駆細胞の増殖が大幅に培地12,13,14にソニックヘッジホッグ（Shh）を追加することによって延長することができます。ラミニンは、神経突起伸長16,17を促進するポリ- D -リジンに加え、基質として添加することができる。顆粒細胞培養のこれらの機能は、顆粒ニューロンの生物学や神経細胞6,18,19に前駆細胞の分化の調節のどちらかを研究するためのシステムを提供する。
出生後のマウスから単離した小脳細胞は最初に細胞周期8のさまざまな段階で顆粒ニューロンと顆粒ニューロン前駆細胞の混合物で構成されています。アストログリアと介在絶縁/文化の中で存在し、顆粒ニューロンと顆粒前駆細胞のさらなる精製（95％-99％）はPercoll勾配分離4によって達成されることもあります。 Percoll勾配分離のステップを使用せずに得られる豊かな顆粒細胞は、18,19,20の顆粒ニューロン前駆細胞の増殖と分化の調節を研究するために使用されている。このの確証では、我々は人口の細胞はPercoll勾配分離ステップは数日間細胞周期に残っているがShhのために確実に対応バイパスすることによって、分離されたことに気付く、と示されているようにShhの添加なしで、ほとんど増殖は、培養液に存在すること細胞増殖のメーカーで染色することによって、Ki67。しかし、文化はin vitroでの数日間を超えて使用する場合は、それはPercoll勾配のステップは、非神経細胞を増殖さ顆粒ニューロンの汚染を減少させるために含まれることをお勧めします。
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Acknowledgments
我々は、貴重な提案をバーバラカルレッティとアンナマリーケニーに感謝します。 、DK07328：HYLはトレーニンググラント"生化学分子生物学ホルモン"によってサポートされています。 NIHの助成金5R01 NS16951（CAM）によって部分的にサポート。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell strainer with 70μm mesh pore | BD Biosciences | 352350 | |
| Spinal Needle | BD Biosciences | 405182 | 20G x 3-1/2 inches |
| Poly-D-Lysine mol wt>300,000 | Sigma-Aldrich | P1024 | Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested. |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P-1644 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | Must be calcium and magnesium free. |
| Neurobasal A-Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| Glutamax I supplement | Invitrogen | 35050-061 | |
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| 12-mm circle coverslips | Carolina Biological | 63-3029 | These are made in Germany by Deckgluder. |
| 25-mm circle coverslips | Carolina Biological | 63-3037 | These are made in Germany by Deckgluder. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK 003150 | Kit is good for five isolations. |
| Permaset scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6782 | |
| Dumont #5 (Dumostar) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4978 | |
| 4-well culture dish | Nalge Nunc international | 176740 | |
| 6-well culture dish | Nalge Nunc international | 140685 |
References
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