Выделение и культуры послеродовой мыши мозжечка гранул клеток-предшественников нейронов и нейронов

Summary

Здесь мы представляем метод, чтобы изолировать и культуры мозжечка гранул нейронных клеток-предшественников нейронов мозжечка и гранулы из послеродового мыши.

Abstract

Коре мозжечка является хорошо описывается структура, которая предоставляет уникальные возможности для изучения свойств нейронов и развитие ^1,2. Из мозжечка нейронов типов (зернистых клеток, клеток Пуркинье и тормозные интернейроны), гранулы нейроны являются на сегодняшний день самая многочисленная и наиболее распространенный тип нейронов в мозге млекопитающих. У грызунов, мозжечковые нейроны гранулы образуются в течение первых двух послеродовых недель из клеток-предшественников в наружный слой коры мозжечка, внешний слой гранул (EGL). Протокол, представленные здесь описываются методы обогащения и нейронов культуры гранул и их клеток-предшественников из послеродовой мыши мозжечка. Мы опишем процедуры получения культур повышения чистоты ^3,4, которые могут быть использованы для изучения дифференциации пролиферирующих клеток-предшественников нейронов в гранулы ^5,6. Как только клетки-предшественники дифференцировать, культур также обеспечить однородное население гранул нейронов для экспериментальных манипуляций и характеристику таких явлений, как синаптогенез, глутамат функции рецептора ^7, взаимодействие с другими очищенные клетки мозжечка ^8,9 или гибель клеток ^7.

Protocol

Часть 1: Настройка (1-2 дней до вскрытия) (не показано на видео)

1. ПОДГОТОВКА КУЛЬТУРА РЕШЕНИЯ И СМИ:
   • 4X CMF-PBS-ЭДТА (кальция и магния свободной фосфатным буферным физиологическим раствором ЭДТА для разведения Перколла): на литр, добавьте 32 г хлористого натрия, 1,2 г хлорида калия, 8 г сахара, 2 г NaH ₂ PO _4, 1 г KH ₂ PO _4, 8 мл 2% NaHCO ₃ акции, 10 мл 1М ЭДТА (рН 8,0), к дистиллированной / деионизированной водой. Регулировка громкости на 1 л и рН до 7,4. Фильтры стерилизовать.
   • HBSS-глюкозы: Добавить глюкозы (6 г / л) с кальцием и магнием баланс свободного Хэнка солевом растворе (HBSS) и стерильный фильтр. 500 мл можно хранить при температуре 4 ° С не более месяца.
   • КУЛЬТУРА СМИ: бессывороточной среде (SFM) и 10% FBS среду. Для 48 мл Neurobasal-Medium добавить 500 мкл 100X GlutaMAX I, 500 мкл 100X Пенициллин-Стрептомицин (конечная 100 единиц пенициллина и 100 мкг стрептомицина), 6,25 мкл 2 М KCl (конечная 250 мкм). Раскол в 2 аликвоты 9 мл и 40 мл. Для подготовки 10% FBS среду, добавить 1 мл тепла инактивированной FBS к 9 мл аликвоту. Для подготовки УЛ, добавьте 800 мкл сыворотки бесплатное приложение B-27 на 40 мл аликвоту. Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С в течение не более 2 недель. Для достижения наилучших результатов сделать новые средства массовой информации для каждого эксперимента.
2. ПОДГОТОВКА Перколла разведения:
   • Перколла поставляется в виде жидкости, и она должна быть подкисленной перед использованием. Для подготовки акции, добавить 1 н мало-помалу Перколла решение за 1-2 часа до периода рН 7,4 будет достигнута. Добавление HCl слишком быстро приведет Перколла к агрегации. Примерно 6.5ml 1 н соляной кислоты, необходимые для каждого литра Перколла. Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° C.
   • 35% и 60% (по объему: объем) Перколла разведения будут использоваться в шаге градиента Перколла. Подготовка 100 мл Перколла разведения, содержащего 35 или 60 мл Перколла акций, 25 мл 4 раза CMF-PBS-ЭДТА и дистиллированной / деионизированной H2O до конечного объема. Добавить несколько капель толуидиновым синим к 60%-ный раствор, это поможет визуализировать интерфейс и клеток. Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° C.
   • 4X CMF-PBS-ЭДТА не должен быть старше 3 месяцев, как неадекватные буферизации будет вызывать повышенную гибель клеток во время процедуры.
3. ПОДГОТОВКА покровные: Стекло покровные (лучше всего, если от Каролины Биологические Компания питания) промывают 10% HCl ночь при комнатной температуре с легким волнением, тщательно промыть дистиллированной / deonized водой и хранят в 70% этанола. Перед использованием одного покровные являются огненно-стерилизовать кратко удерживая их пинцетом над открытым огнем (горелки Бунзена) до этанола испаряется. 12-мм покровные стекла могут быть размещены в 4-х и культуре тарелки и 25-мм покровные в 6-луночных культуры.
4. ПОКРЫТИЕ КУЛЬТУРА СУДОВ с подложкой: Для иммунофлуоресцентного метода или препарата покровные стекла лечение более приемлемым, поскольку они легко могут быть установлены на стеклах для визуализации под микроскопом. Когда большое количество клеток, необходимых для сбора белка или РНК, образцы, клетки можно культивировать на пластиковых культуры dishes.The ночь перед рассечение, стекла покровные или пластиковой посуды для культуры должна быть покрыта поли-D-лизин (500 мкг / мл; 800 мкл / лунку для 6-луночных или 350 мкл / лунку для 4-луночных). 5 мг / мл маточного раствора поли-D-лизин хранится при температуре -20 ° С, затем разводят в стерильной дистиллированной / deonized воды и стерильно фильтруют непосредственно перед использованием. Культура судов инкубируют при 37 ° С в течение ночи (или, по крайней мере за 2 часа до покрытия) и дважды промывают стерильной дистиллированной / deonized воду прямо перед покрытием.
5. ПОДГОТОВКА PREPLATING БЛЮДА: Эти блюда будет использоваться для предварительного покрытия изолированных клетках мозжечка до культуры для удаления глиальных загрязняющих веществ, которые придерживаются более легко в более низкой концентрации субстрата. Пальто два 60-мм пластиковой посуды культуры с 4 мл на чашку поли-D-лизин (100 мкг / мл; Обратите внимание, это 1 / 5 от концентрации используются для культивирования). Инкубировать при 37 ° С в течение ночи (или, по крайней мере за 2 часа до вскрытия). Прямо перед рассечение, удалить поли-D-лизин решение, мыть посуду в два раза стерильной водой и дать высохнуть в капюшоне.
6. Стерилизовать рассечение инструментов в автоклаве или в день вскрытия, погрузить инструменты в 70% этаноле в течение 20 минут. Необходимые инструменты: Permaset ножницы, ножницы microdissecting, четыре Дюмон # 5 рассекает щипцами.

Часть 2: Подготовка к Dissection (день вскрытия) - (Продемонстрированный в видео)

Все последующие процедуры проводятся в капюшоне культуры ткани, если не указано.

1. Протрите рассекает район с 70% этанола. Теплый СМИ до 37 ° С на водяной бане или в 5% СО ₂ 37 ° C инкубатора.
2. При запуске новой системы Папаин Диссоциация Kit (Уортингтон), приготовьте раствор альбумина-ovomucoid ингибитора. Добавить 32 млиз EBSS (сбалансированный солевой раствор Эрла, при условии, в комплект), чтобы альбумин-ovomucoid ингибитор смеси и позволяют растворить содержимое при подготовке других компонентов. Развести для первого использования, а затем сохранить оставшийся раствор при температуре 2-8 ° С и использовать до пяти выделений разрешено каждом комплекте будут завершены.
3. Добавьте 5 мл EBSS одному папаин флакон из Диссоциация Kit (каждого флакона достаточно для диссоциации от 4 до 15 cerebella от послеродовой 5-й день мышей). Место папаин флакона в 5% СО ₂ 37 ° C инкубатора или 37 ° С на водяной бане 5 до 10 минут, пока папаин полностью не растворится и решение представляется ясным. Поддерживать растворе при комнатной температуре в течение рассечение.
4. Добавить 500 мкл EBSS одному ДНКазы флакон из пакета диссоциации. Осторожно перемешать, нажав флакон с ДНКазы чувствителен к сдвигу денатурации. Добавить 250 мкл этого раствора флакон, содержащий папаин (конечная концентрация составляет 20 ед / мл папаин и 0,005% ДНКазы). Сохранить оставшиеся флакон ДНКазы для использования в шаге 5.1 или 6.1.

Часть 3: Разбор и мозговых оболочек удаление

1. Оптимальный возраст для гранул культуре клеток мышей C57BL/6J является послеродовая день 4-6, когда число прародителей ЗК в EGL peaks1, 10. Рассеките щенков по одному за раз и, как вы более подробно ознакомиться с мозжечковой рассечение попытаться уменьшить время вскрытия не более 6 минут на щенка. Скорость имеет сущности.
   Если шаг Перколла градиент обходится, восемь послеродовых дней-5 щенков мыши может дать достаточное количество клеток для одного 6-и культуру пластину (или шесть 25-мм покровные) или в течение шести 4-а культуры пластин (или двадцать четыре 12 - мм покровные). Приблизительное количество составляет от 4 до 5x106 клеток на щенка и покрытие плотность может варьироваться от 1 до 5X105 cells/cm2. Так как 15-20% клетки теряются во время Перколла step4, больше животных, необходимое для получения желаемого же плотность клеток.
2. Внесите 15 мл HBSS-глюкозы в 60-мм пластиковыми блюдо культуры тканей и 10 мл в стерильный Сокол 15 мл коническую пластиковую трубку. Положите на льду.
3. Вне капот, протрите глава щенка с 70% этанола. Используйте Permaset ножницы, чтобы отрубить голову щенка. (Обезглавливание не будет показано в видео.)
4. В капоте, удерживая голову щипцами Дюмон, чтобы вы могли ясно видеть заднюю часть черепа. Доступ мозга, вставив microdissecting ножницы в затылочное отверстие и резки прямо к глазам. Использование щипцов, очистить от кожи и поднимите череп подвергать мозга. Использование Дюмон щипцы, отщипывать мозжечка и окружающих среднего мозга и передать его на блюдо с HBSS-глюкозы. (Это легче манипулировать мозжечка и удалить мозговых оболочек, если мозжечок еще привязаны к окружающим тканям).
5. Под микроскопом рассекает, мягко кожуры мозговых оболочек от мозжечка, а также между долями с одним прекрасным Дюмон # 5 щипцов во время использования других пинцетом, чтобы закрепить вниз мозжечка к пластине. Вы заметите, кровеносные сосуды на поверхности мозжечка. Эти кровеносные сосуды, это хороший способ выявить мозговые оболочки. Удалить мозговых оболочек до мозжечка приобретает матовый белый цвет. Отдельные мозжечка от остальной части мозга. Включите его в брюшную сторону и снять сосудистого сплетения, которая выглядит как красноватый ленты между вентральной мозжечка и смежных мозга. Место каждого мозжечка в холодной HBSS-глюкозы в 15 мл коническую трубку на льду, как только расчленены. Изменение рассекает решение на свежий HBSS-глюкозы после вскрытия 3 мозги.

Часть 4: Сотовый подвески

1. После того как все вскрытия закончите, удалите HBSS-глюкозы из трубы и заменить его папаин решения сделали в шаге 2.4. Хотя комплект рекомендует резки ткани в мелкие кусочки, мы находим, что не стоит резать или рубить cerebella в этом возрасте. Место ткань + папаин решение (в 15 мл коническую трубку) в 37 ° С водяной бане или 5% СО ₂ 37 ° C инкубаторе в течение 15 до 20 минут. За 4 до 8 cerebella, 15 минут при 37 ° C достаточно, а для большего числа cerebella 20 до 30 минут, тем лучше. Аккуратно агитировать трубку каждые 3 до 4 минут.
2. Измельченного в порошок смеси с стерильных P1000 аэрозоля пипетки, которая была покрыта FBS. Делайте это осторожно шаг, чтобы предотвратить образование воздушных пузырьков. Пожар полированного стекла пипеток можно использовать, но мы обнаружили, что сыворотка покрытием стерильной P1000 советы аэрозоля работать так же хорошо. Для пальто пипетки с ФБС, ФБС пипетку вверх и вниз в два раза непосредственно перед употреблением. Около 10 вверх и вниз, движения с пипетку, достаточно, чтобы отделить ткани. Решение будет облачно. Разрешить подвески сидеть в течение 30-60 секунд, так что любые большие куски ткани недиссоциированных осядет на дно трубы.
3. Удаление взвешенных клеток (осторожны, чтобы не удалить недиссоциированных частей ткани на бottom) в свежем 15 мл коническую трубку с сывороткой покрытием кончика пипетки. Центрифуга примерно 200xg в течение 5 минут при комнатной температуре. Подготовка ресуспензии среды. Для этого смешайте 2,7 мл EBSS 300 мкл восстановленного альбумин-ovomucoid раствора ингибитора в стерильную пробирку. Добавить 150 мкл раствора ДНКазы с шагом 2.4.
4. После центрифугирования супернатант отказаться и сразу ресуспендируют осадок клеток в разбавленных ДНКазы / раствор альбумина ингибитор подготовлен в шаге 4.3 с сывороткой покрытием P1000 аэрозоля пипетки.
5. Подготовка разрывным градиентом плотности следующим образом. Добавьте 5 мл альбумина ovomucoid ингибитор решение 15 мл коническую трубку. Тщательно слой клеточной суспензии на вершине. Центрифуга примерно 70xg в течение 6 минут при комнатной температуре. Расхождение между клетками гранул на дне пробирки, мембранные фрагменты остаются на границе раздела.
6. Если вы хотите получить культур, которые обогащены зернистых клеток, обойти разделения Перколла градиент шаг (что и дает чистый культурах мозжечка ЗК), и перейдем к части 6. Если вы хотите еще больше изолировать зернистых клеток из глии и крупных интернейронов разделением градиент Перколла, переходите к Части 5. Использование шаг градиента Перколла позволит снизить выход клеток. В наших руках, снижение урожайности примерно на 20-35%. Однако, есть увеличение обогащения гранул нейронов и клеток-предшественников, примерно с 90% до 95-99%.

Часть 5: Перколла Градиент Разделение

1. Удалите супернатант и сразу ресуспендируют осадок в 2 мл HBSS-глюкозы с 50 мкл ДНКазы с шагом 2.4. Фильтры клеточной суспензии хотя нейлоновая сетка (размер пор 70 мкм) под действием силы тяжести. Этот шаг приводит к удалению большого не-нервных клеток и обеспечивает лучшую суспензии отдельных клеток.
2. Приготовьте два пожарных полированного стекла Пастера пипеток. Чтобы сделать это, мягко пламени кончик стеклянной пипетки, пока край шлифуется и пипетки отверстия составляет 40-50% от первоначального размера. Заботьтесь, чтобы не сделать открытия слишком мал.
3. Подготовка Перколла градиента. Место 10 мл 35% раствора в Перколла 50 мл стерильного коническую трубку. 60% Перколла (10 мл) загружается в 10 мл стерильного шприца с иглой стерильной спинного прилагается. Аккуратно слоя 60% Перколла решение под 35% раствора, путем добавления 60%-ный раствор в нижней части трубки с иглой спинного. Позаботьтесь, чтобы сохранить резкой границы между двумя слоями. Добавить клеткам в верхней части градиент, используя огневой полировкой пипетки, аккуратно складывая их вдоль боковой трубкой, не нарушая интерфейс.
4. Аккуратно положите трубку в центрифуге и центрифуге при 1800xg. Нарастить скорость на один шаг каждые 20 секунд (с шагом скорости следующим образом: приблизительно 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg), так что она занимает около 2 минут, чтобы достичь желаемой скорости. Начало таймер до 10 мин, когда 1800xg будет достигнута. Когда закончите, уменьшают скорость постепенно один шаг каждые 20 секунд.
5. Снимите верхнюю интерфейс градиент (содержащих большое глия, клетки Пуркинье и интернейроны) и выбросьте.
6. Осторожно удалите клетки на границе между 35% и 60% Перколла с огневой полировкой пипетки и трансфер в 50 мл коническую трубку. Ресуспендируют в 3-х томов HBSS-глюкозы и перемешать путем обращения в несколько раз. Центрифуга течение 5 минут при 1100xg.
7. Удалить супернатант и добавьте 4 мл 10%-средний ФПС с 50 мкл ДНКазы. Ресуспендируют гранулы мягко использованием огневой полировкой пипетки в единое клеточной суспензии. Переходите к пункту 6.2.

Часть 6: Pre-покрытие и покрытие

1. Удалите супернатант и сразу ресуспендирования окатышей в 4 мл 10%-средний ФПС с 50 мкл ДНКазы с шагом 2.4. Фильтры клеточной суспензии хотя нейлоновая сетка (размер пор 70 мкм) под действием силы тяжести. Этот шаг приводит к удалению большого не-нервных клеток и обеспечивает лучшую суспензии отдельных клеток.
2. Пластина собранных клеток на поли-D-лизин покрытием предварительно покрытие блюдо в течение 20 минут в 5% СО ₂ 37 ° C инкубатора. Повторите с свежим блюдом. Астроглией и более тяжелые клетки успокоиться и придерживаться посуду и оставить небольшие гранулы нейроны и клетки предшественники нейронов плавающим. После инкубации, свободно придерживаться гранул нейроны и клетки предшественники нейронов являются легко смещаются и ослабил с мягким нажатием пластины.
3. Сбор гранул нейроны и клетки предшественники нейронов в 15 мл коническую трубку и центрифуге при 200xg течение 5 минут. Ресуспендируют гранул в 1 мл бессывороточной среде и считать Аликвоту 10 мкл использованием гемоцитометра.
4. Добавить бессывороточной среде для достижения желаемой плотности клеток. Примерные инструкции для количества клеток, чтобы пластина для средней плотности: для 6-луночный, от 3,5 до 4 миллионов клеток, а для 4-луночных, 650000 клеток. Для 6-луночный культуры, я пластины 1,5 мл / хорошо, и в течение 4 хорошо плаTES, я пластины 0,5 мл / лунку. Клетки сохраняются в 5% СО ₂ 37 ° C инкубатора. Изменение среды полностью через 24 часа с последующими изменениями каждые два-три дня.

Discussion

Этот протокол основан на модификации процедуры, которые были описаны в прошлом ^3,7,11. Есть несколько важных моментов, как описано ниже.

Гранулы нейронов и клеток-предшественников, придерживаются в течение 2 часов обшивки. Здоровые клетки имеют морфологию круглые под фазово-контрастным микроскопом ^4. В течение 24 часов после покрытия, здоровые клетки будут распространяться равномерно вокруг покровные или пластиковой хорошо и сформирует процессов. Во время первого изменения среды, после 24 часов, там будет несколько мертвых плавающих клеток. Это нормально, так как мало клеток умрет или станет нездоровая в процессе диссоциации. Однако, если по истечении 48 часов клетки слипаются вместе с варикоз на их процессы, либо нездоровые клетки или поли-D-лизин субстрата является токсичным. Как и с большинством субстратов, эффективность поли-D-лизин много зависимых и каждой новой партии должно быть проверено. Изображения здоровых культур можно найти в ссылках ^{4,11 и 20.} Здоровые клетки могут поддерживаться в культуре в течение двух недель ^8.

Прародителей гранул нейрона начинают дифференцироваться на покрытие ^8,12,13,14. После оптимальной плотности покрытия устанавливается на учебу, она должна быть сохранена, потому что распространению способствуют такие факторы, как Нотч сигнализации ^15, а также клетки размножаются больше при более высокой плотности. Распространение прародителей гранул нейрон может быть значительно продлен добавления звуковых ежа (Тсс) в среду ^12,13,14. Ламинин также могут быть добавлены в качестве субстрата в дополнение к поли-D-лизин содействовать аксонов ^16,17. Эти особенности культуры клеток гранулы предлагаем систему для изучения либо биологии гранул нейронов или регулирование дифференциации предшественников клеток в нейроны ^6,18,19.

Изолированные клетки мозжечка от послеродовых мышей первоначальном этапе будет состоять из смеси гранул предшественников нейронов и нейронных гранулы на разных стадиях клеточного цикла ^8. Есть также астроглией и интернейронов присутствует в изоляции / культуре и дальнейшей очистки гранул нейронов и гранулы прародителей (95% -99%) достигается за счет разделения Перколла градиентом ^4. Обогащенный зернистых клеток, полученных без использования стадии разделения градиент Перколла были использованы для изучения регуляции пролиферации и дифференцировки нейронов гранул предков, ^18,19,20. В подтверждение этого, мы обнаружили, что клетки в популяции изолированы, минуя разделение Перколла градиент шаг принять решительные ответные меры Тсс, оставаясь в клеточный цикл на несколько дней, и что без Тсс Кроме того, существует очень мало распространение в культурах, как указано окрашиванием производитель пролиферацию клеток, Ki67. Однако, если культуры, которые будут использоваться за несколько дней в лабораторных условиях, рекомендуется, чтобы шаг Перколла градиент быть включен для уменьшения загрязнения гранул нейронов пролиферирующих не-нервных клеток.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell strainer with 70μm mesh pore	BD Biosciences	352350
Spinal Needle	BD Biosciences	405182	20G x 3-1/2 inches
Poly-D-Lysine mol wt>300,000	Sigma-Aldrich	P1024	Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested.
Percoll	Sigma-Aldrich	P-1644
Penicillin-Streptomycin (100X)	Sigma-Aldrich	P4333
HBSS	Invitrogen	14175-103	Must be calcium and magnesium free.
Neurobasal A-Medium	Invitrogen	10888-022
Glutamax I supplement	Invitrogen	35050-061
B-27 Serum Free Supplement (50x)	Invitrogen	17504-044
12-mm circle coverslips	Carolina Biological	63-3029	These are made in Germany by Deckgluder.
25-mm circle coverslips	Carolina Biological	63-3037	These are made in Germany by Deckgluder.
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical	LK 003150	Kit is good for five isolations.
Permaset scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS6782
Dumont #5 (Dumostar)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS4978
4-well culture dish	Nalge Nunc international	176740
6-well culture dish	Nalge Nunc international	140685