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Biology

अलगाव और प्रसवोत्तर माउस अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और न्यूरॉन्स की संस्कृति

Published: January 16, 2009 doi: 10.3791/990
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 2,4
1Department of Genetics and Development, Columbia University, 2Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University, 3Department of Neuroscience, Columbia University, 4Department of Neurology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

Summary

यहाँ हम एक अलग करने के लिए विधि और संस्कृति अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन पूर्वज और प्रसवोत्तर माउस से कोशिकाओं अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स उपस्थित थे.

Abstract

अनुमस्तिष्क प्रांतस्था एक अच्छी तरह से वर्णित संरचना है कि neuronal गुण और विकास 1,2 के अध्ययन के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है. अनुमस्तिष्क neuronal प्रकार (ग्रेन्युल कोशिकाओं, Purkinje कोशिकाओं और निरोधात्मक interneurons), ग्रेन्युल न्यूरॉन्स द्वारा सबसे अनेक दूर कर रहे हैं और स्तनधारी दिमाग में न्यूरॉन्स की सबसे प्रचुर मात्रा में टाइप कर रहे हैं. कृन्तकों में, अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स अनुमस्तिष्क प्रांतस्था, बाहरी ग्रेन्युल परत (EGL) के बाह्यतम परत में पहले दो पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से प्रसवोत्तर सप्ताह के दौरान उत्पन्न कर रहे हैं. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल तकनीक समृद्ध संस्कृति और ग्रेन्युल न्यूरॉन्स और प्रसवोत्तर माउस सेरिबैलम से उनके पूर्वज कोशिकाओं का वर्णन करता है. हम प्रक्रियाओं का वर्णन करने के लिए बढ़ती 3,4 शुद्धता की संस्कृतियों, जो ग्रेन्युल 5,6 न्यूरॉन्स में पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं proliferating के भेदभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्राप्त होगा. एक बार पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं अंतर, संस्कृतियों भी प्रयोगात्मक और synaptogenesis, ग्लूटामेट रिसेप्टर समारोह 7, अन्य शुद्ध अनुमस्तिष्क 8,9 कोशिकाओं या सेल मौत 7 के साथ बातचीत के रूप में घटना के हेरफेर के लक्षण वर्णन के लिए ग्रेन्युल न्यूरॉन्स की एक समरूप जनसंख्या प्रदान.

Protocol

भाग 1: स्थापना (1-2 दिनों के विच्छेदन के पहले) (वीडियो पर नहीं दिखाया गया)

  1. संस्कृति समाधान और मीडिया की तैयारी:
    • 4X (कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त फॉस्फेट बफर Percoll dilutions के लिए खारा EDTA) सीएमएफ - पीबीएस - EDTA: प्रति लीटर 32 छ NaCl, 1.2 ग्राम KCl, 8 ग्राम ग्लूकोज, 2 नाह छ दो पीओ 4, 1 जी के.एच. 2 पीओ जोड़ने 4, 8 मिलीलीटर NaHCO 2% 3 शेयर, 10 मिलीलीटर 1M आसुत / विआयनीकृत जल EDTA (8.0 पीएच). 1 लीटर और 7.4 पीएच मात्रा समायोजित करें. बाँझ फ़िल्टर.
    • HBSS - ग्लूकोज: कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त हांक बैलेंस नमक (HBSS) समाधान और बाँझ फिल्टर जोड़ें ग्लूकोज (6 ग्राम / लीटर). 500 मिलीलीटर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है.
    • सीरम मुक्त मध्यम (SFM) और 10% FBS मध्यम: संस्कृति मीडिया. 48 मिलीलीटर Neurobasal एक मध्यम 500 μl 100X GlutaMAX मैं, 500 μl 100X (अंतिम 100 इकाइयों पेनिसिलिन और 100 μg स्ट्रेप्टोमाइसिन) पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन, 6.25 μl 2 एम KCl (250 अंतिम सुक्ष्ममापी) जोड़ें. 9 मिलीलीटर की 2 aliquots और 40 मिलीलीटर में भाजित. 10% FBS मध्यम तैयार करने के लिए, 9 मिलीलीटर विभाज्य गर्मी निष्क्रिय FBS 1ml जोड़ने. SFM तैयार करने के लिए, सीरम मुक्त 40 मिलीलीटर विभाज्य पूरक B-27 के 800 μl जोड़ें. बाँझ फ़िल्टर और 4 ° C में 2 सप्ताह की एक अधिकतम के लिए दुकान. सर्वोत्तम परिणामों के लिए एक प्रयोग के लिए ताजा मीडिया बनाने.
  2. PERCOLL dilutions की तैयारी:
    • Percoll एक तरल के रूप में आपूर्ति की है और यह प्रयोग करने से पहले acidified होना चाहिए. स्टॉक तैयार करने के लिए, एक 1-2 घंटे की अवधि में Percoll समाधान के लिए थोड़ा के द्वारा 1N एचसीएल थोड़ा जोड़ने जब तक 7.4 पीएच तक पहुँच जाता है. एचसीएल भी तेजी से जोड़ना कुल के लिए Percoll हो जाएगा. 1N एचसीएल के लगभग 6.5ml Percoll लीटर प्रत्येक के लिए आवश्यक हैं. बाँझ फ़िल्टर और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस
    • एक 35% और 60% (खंड: खंड) Percoll कमजोर पड़ने Percoll ढाल कदम में उपयोग किया जाएगा. 100 मिलीलीटर Percoll Percoll शेयर के 35 या 60 मिलीलीटर युक्त dilutions तैयार सीएमएफ 4X - पीबीएस - EDTA और आसुत के 25 मिलीग्राम / अंतिम मात्रा करने के लिए H2O विआयनीकृत. Toluidine की कुछ बूँदें 60% के समाधान के लिए नीले जोड़ें, यह इंटरफ़ेस और कोशिकाओं कल्पना में मदद मिलेगी. बाँझ फ़िल्टर और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस
    • 4X सीएमएफ - पीबीएस - EDTA 3 महीने से अधिक उम्र के नहीं हो सकता है, के रूप में अपर्याप्त बफरिंग प्रक्रिया के दौरान वृद्धि हुई है कोशिका मृत्यु का कारण होना चाहिए.
  3. एचसीएल 10% हल्के आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर रातोंरात के साथ तैयारी COVERSLIPS: ग्लास (कैरोलिना जैविक आपूर्ति कंपनी से सबसे अच्छा है अगर) coverslips धो रहे हैं, आसुत / deonized पानी के साथ अच्छी तरह से rinsed और 70% इथेनॉल में संग्रहीत. उपयोग करने से पहले, एकल coverslips लौ निष्फल संक्षेप में इथेनॉल evaporates जब तक एक खुला लौ (Bunsen बर्नर) पर संदंश के साथ उन्हें पकड़ कर. 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में 4 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों और 25 मिमी coverslips में 12 मिमी कांच coverslips रखा जा सकता है.
  4. कोटिंग सब्सट्रेट के साथ संस्कृति जहाजों: immunofluorescence धुंधला हो जाना या दवा उपचार कांच coverslips के लिए अधिक उपयुक्त हैं क्योंकि वे आसानी से एक खुर्दबीन के नीचे दृश्य के लिए किया जा सकता है गिलास स्लाइड पर मुहिम शुरू की. जब कोशिकाओं की बड़ी संख्या प्रोटीन या शाही सेना के नमूने इकट्ठा करने के लिए की जरूरत है, कोशिकाओं प्लास्टिक की संस्कृति पर संवर्धित किया जा सकता है विच्छेदन पहले dishes.The रात, कांच या coverslips संस्कृति के लिए प्लास्टिक के बर्तन पाली - डी lysine (500 μg / एमएल के साथ लेपित किया जाना चाहिए; μl / 6 अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्लेटों के लिए 800 या 350 μl / 4 अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्लेटों के लिए). 5 मिलीग्राम / एमएल पाली-D-lysine के शेयर समाधान -20 ° सी, तो बाँझ पानी आसुत / deonized और उपयोग करने से पहले बाँझ फ़िल्टर सही में पतला पर संग्रहीत है. संस्कृति वाहिकाओं 37 में incubated हैं डिग्री सेल्सियस (या के लिए कम से कम चढ़ाना पहले 2 घंटे के लिए) रातोंरात और चढ़ाना पहले बाँझ पानी आसुत / deonized सही के साथ दो बार धोया.
  5. PREPLATING बर्तन की तैयारी: ये व्यंजन पृथक अनुमस्तिष्क कोशिकाओं पूर्व चढ़ाना संस्कृति से पहले glial contaminants, जो सब्सट्रेट के एक कम एकाग्रता के लिए और अधिक आसानी से पालन को हटाने के लिए के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. कोट दो 60 मिमी पाली - डी lysine (ध्यान दें यह / 5 1 संवर्धन के लिए इस्तेमाल किया एकाग्रता के 100 μg / एमएल) के प्रति पकवान 4 मिलीलीटर के साथ प्लास्टिक की संस्कृति व्यंजन. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस रातोंरात (या के लिए विच्छेदन से पहले कम से कम 2 घंटे के लिए). विच्छेदन से पहले ही, पाली - डी lysine समाधान निकालने के लिए, व्यंजन बाँझ पानी के साथ दो बार धोने और हुड में सूखे की अनुमति.
  6. आटोक्लेव या विच्छेदन के दिन पर विच्छेदन उपकरण जीवाणुरहित करने के लिए, 70% इथेनॉल में 20 मिनट के लिए उपकरण विसर्जित. आवश्यक उपकरण: Permaset कैंची, microdissecting कैंची, चार Dumont # 5 विदारक संदंश.

भाग 2: विच्छेदन (विच्छेदन के दिन) के लिए तैयारी - (वीडियो में विरोधी)

निम्नलिखित प्रक्रियाओं के सभी एक टिशू कल्चर हुड में प्रदर्शन कर रहे हैं जब तक उल्लेख किया है.

  1. नीचे 70% इथेनॉल के साथ विदारक क्षेत्र साफ कर लें. 37 के लिए डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में या 5% सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में मीडिया गर्म.
  2. जब एक नया papain हदबंदी प्रणाली किट (वर्दिग्टन) शुरू, albumin ovomucoid अवरोध करनेवाला के समाधान तैयार करते हैं. 32 मिलीलीटर जोड़ेंEBSS (Earle बैलेंस्ड नमक समाधान, किट में दिए गए) अवरोध करनेवाला albumin ovomucoid मिश्रण करने के लिए और सामग्री, जबकि अन्य घटकों की तैयारी भंग करने की अनुमति. पहली उपयोग के लिए reconstitute, तो 2-8 पर शेष समाधान की दुकान डिग्री सेल्सियस और उपयोग करें जब तक पांच प्रत्येक किट द्वारा अनुमति दी isolations पूरा कर रहे हैं.
  3. हदबंदी किट (प्रत्येक शीशी प्रसव के बाद 5 दिन चूहों से 4 से 15 cerebella के पृथक्करण के लिए पर्याप्त है) से papain शीशी EBSS के 5 मिलीलीटर जोड़ें. एक 5% सीओ 37 2 papain शीशी में रखें डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर या 37 डिग्री सेल्सियस 5 से 10 मिनट के लिए पानी स्नान papain जब तक पूरी तरह भंग कर रहा है और समाधान स्पष्ट प्रतीत होता है . विच्छेदन के दौरान कमरे के तापमान पर समाधान बनाए रखें.
  4. एक पृथक्करण किट से DNase शीशी EBSS के 500 μl जोड़ें. शीशी दोहन के बाद DNase कतरनी विकृतीकरण के प्रति संवेदनशील है धीरे मिलाएं. Papain (अंतिम एकाग्रता 20 इकाइयों / एमएल papain और 0.005% DNase) युक्त शीशी के लिए इस समाधान के 250 μl जोड़ें. 5.1 या 6.1 कदम में उपयोग करने के लिए शेष DNase शीशी सहेजें.

भाग 3: विच्छेदन meninges और हटाना

  1. C57BL/6J चूहों से ग्रेन्युल सेल संस्कृति के लिए इष्टतम उम्र प्रसव के बाद 4-6 दिन, जब peaks1 EGL, 10 में ग्रेन्युल सेल progenitors की संख्या. पिल्ले एक समय में एक काटना और के रूप में आप और अधिक अनुमस्तिष्क विच्छेदन के साथ परिचित हो पिल्ला प्रति अधिक नहीं 6 से अधिक मिनट के लिए विच्छेदन के समय को कम करने की कोशिश. स्पीड का सार है.
    यदि Percoll ढाल कदम नजरअंदाज है, आठ प्रसवोत्तर दिन 5 माउस पिल्ले एक संस्कृति 6 अच्छी तरह से थाली (या छह coverslips 25 मिमी) के लिए या छह 4-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों (या 12 बीस - चार के लिए पर्याप्त कक्षों उपज कर सकते हैं - मिमी) coverslips. लगभग उपज है पिल्ला और चढ़ाना घनत्व प्रति 4 से 5x106 कोशिकाओं के बीच 1 और 5X105 cells/cm2 रेंज कर सकते हैं. के बाद से 15-20% कोशिकाओं Percoll 4 के दौरान खो रहे हैं, अधिक पशुओं के लिए एक ही वांछित सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए की जरूरत है.
  2. पिपेट एक 60 मिमी प्लास्टिक टिशू कल्चर और एक बाँझ फाल्कन 15 मिलीलीटर शंक्वाकार प्लास्टिक ट्यूब में 10 मिलीलीटर पकवान में 15 मिलीलीटर HBSS ग्लूकोज की. बर्फ पर रखो.
  3. हुड के बाहर, 70% इथेनॉल के साथ पिल्ला के सिर पोछ लो. Permaset कैंची का प्रयोग करें पिल्ला सिर काटना. (वीडियो में कत्ल नहीं दिखाया जाएगा.)
  4. हुड में, डुमोंट संदंश के साथ सिर पकड़ इतनी है कि आप स्पष्ट रूप से खोपड़ी के पीछे देख सकते हैं. रंध्र मैग्नम में microdissecting कैंची डालने और आँखों की ओर सीधे काटने से मस्तिष्क पर पहुँचें. संदंश का प्रयोग, त्वचा छील दूर और खोपड़ी मस्तिष्क बेनकाब उठा. Dumont संदंश का प्रयोग, सेरिबैलम और आसपास midbrain चुटकी और यह HBSS-ग्लूकोज के साथ डिश के लिए स्थानांतरण. (यह आसान है सेरिबैलम हेरफेर और meninges दूर अगर सेरिबैलम अभी भी आसपास के ऊतकों से जुड़ा हुआ है).
  5. विदारक माइक्रोस्कोप के तहत धीरे सेरिबैलम बंद meninges छील और यह भी एक ठीक Dumont # 5 जबकि अन्य संदंश का उपयोग करने के लिए नीचे थाली करने के लिए सेरिबैलम लंगर संदंश के साथ lobes के बीच. आप सेरिबैलम की सतह पर रक्त वाहिकाओं को नोटिस जाएगा. ये रक्त वाहिकाओं meninges की पहचान के लिए एक अच्छा तरीका है. Meninges निकालें जब तक सेरिबैलम एक उलझा हुआ सफेद उपस्थिति पर ले जाता है. सेरिबैलम midbrain के बाकी हिस्सों से अलग करें. यह उसके उदर पक्ष को मुड़ें और हटायें रंजित जाल है, जो उदर सेरिबैलम और आसन्न midbrain के बीच एक लाल रिबन की तरह लग रहा है. ठंड HBSS शर्करा में एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में बर्फ के रूप में जल्द ही के रूप में dissected पर प्रत्येक सेरिबैलम प्लेस. 3 दिमाग विदारक बाद विदारक HBSS ग्लूकोज ताजा समाधान बदलें.

भाग 4: सेल निलंबन

  1. एक बार सभी dissections खत्म हो रहे हैं, ट्यूब से HBSS ग्लूकोज को हटा दें और यह papain 2.4 चरण में बनाया समाधान के साथ की जगह. हालांकि किट छोटे टुकड़ों में ऊतक में कटौती की सिफारिश की है, हम पाते हैं कि यह इस उम्र में कटौती या cerebella कीमा के लिए आवश्यक नहीं है. एक 37 में ऊतक + papain समाधान (एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में) प्लेस डिग्री सेल्सियस पानी से स्नान या 5% सीओ 37 2 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर 15 से 20 मिनट के लिए . 4 से 8 cerebella, 37 पर 15 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस पर्याप्त है, cerebella की एक बड़ी संख्या के लिए 20 से 30 मिनट के बेहतर है. धीरे ट्यूब हर 3 से 4 मिनट के आंदोलन.
  2. एक बाँझ P1000 एयरोसोल विंदुक टिप है कि FBS के साथ लेपित किया गया है के साथ मिश्रण Triturate. किसी भी हवाई बुलबुले गठन को रोकने के लिए इस कदम धीरे करो. आग पॉलिश कांच pipettes, इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन हम पाते हैं कि सीरम लेपित बाँझ P1000 एयरोसोल सुझावों बस के रूप में अच्छी तरह से काम करते हैं. FBS साथ विंदुक टिप कोट, विंदुक ऊपर और नीचे दो बार FBS सिर्फ का उपयोग करने से पहले. विंदुक के साथ बारे में 10 ऊपर और नीचे आंदोलनों ऊतक अलग कर देना करने के लिए पर्याप्त हैं. समाधान बादल बन जाएगा. निलंबन 30-60 सेकंड के लिए बैठने के लिए इतना है कि undissociated ऊतक के किसी भी बड़े टुकड़े ट्यूब के नीचे करने के लिए आदी हो जाएगा अनुमति दें.
  3. निलंबित कोशिकाओं (सावधान ख में undissociated ऊतक के टुकड़े नहीं निकाल निकालेंottom एक सीरम लेपित विंदुक टिप के साथ एक ताजा 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में). कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए लगभग 200xg अपकेंद्रित्र. फिर से निलंबन मध्यम तैयार. ऐसा करने के लिए, पुनर्गठन albumin ovomucoid एक बाँझ ट्यूब में अवरोध करनेवाला समाधान के 300 μl के साथ 2.7 मिलीलीटर EBSS मिश्रण. 2.4 कदम से DNase समाधान के 150 μl जोड़ें.
  4. Centrifuging के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्यागने और तुरंत पतला DNase / albumin अवरोध करनेवाला एक सीरम लेपित P1000 एयरोसोल विंदुक टिप के साथ 4.3 चरण में तैयार समाधान में कक्ष गोली का resuspend.
  5. निम्नानुसार एक असंतत घनत्व ढाल तैयार करें. Albumin ovomucoid अवरोध करनेवाला एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें. ध्यान से परत सेल निलंबन शीर्ष पर. कमरे के तापमान पर 6 मिनट के लिए लगभग 70xg अपकेंद्रित्र. ट्यूब के नीचे dissociated गोली कोशिकाओं, झिल्ली टुकड़े इंटरफेस में रहते हैं.
  6. यदि आप संस्कृतियों है कि ग्रेन्युल कोशिकाओं में समृद्ध कर रहे हैं प्राप्त करना चाहते हैं, बाईपास Percoll ढाल जुदाई कदम (जो अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल कोशिकाओं के purer संस्कृतियों पैदावार), और भाग 6 के लिए आगे बढ़ना. यदि आप आगे Percoll ढाल जुदाई द्वारा glia और बड़े interneurons से ग्रेन्युल कोशिकाओं को अलग करना चाहते हैं, भाग 5 के लिए आगे बढ़ना. Percoll ढाल कदम के प्रयोग कक्षों की उपज कम हो जाएगा. हमारे हाथ में उपज में कमी लगभग 20-35% है. हालांकि, वहाँ ग्रेन्युल न्यूरॉन्स लगभग 90% से 95-99% करने के लिए और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के संवर्धन में वृद्धि हुई है.

भाग 5: Percoll ढाल पृथक्करण

  1. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और तुरंत HBSS शर्करा के 2 मिलीलीटर में 2.4 कदम से 50 μl DNase के साथ गोली resuspend. हालांकि गंभीरता से एक नायलॉन जाल (ताकना आकार सुक्ष्ममापी 70) सेल निलंबन फ़िल्टर. यह कदम बड़े गैर neuronal कोशिकाओं को हटाने और एक बेहतर एकल कक्ष निलंबन के लिए प्रदान करता है.
  2. दो आग पॉलिश कांच पाश्चर pipettes तैयार करें. ऐसा करने के लिए, धीरे एक गिलास पिपेट की लौ टिप जब तक बढ़त smoothened और विंदुक बोर मूल आकार के 40-50% है. ध्यान रखना उद्घाटन बहुत छोटा नहीं कर.
  3. Percoll ढाल तैयार. 35% एक 50 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में Percoll समाधान के 10 मिलीलीटर प्लेस. 60% Percoll (10 मिलीलीटर) एक 10 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज में एक बाँझ रीढ़ की हड्डी में सुई संलग्न के साथ भरी हुई है. धीरे परत 60% 35% समाधान के नीचे Percoll रीढ़ की हड्डी में सुई के साथ ट्यूब के नीचे 60% समाधान जोड़कर, समाधान. ख्याल रखना करने के लिए दो परतों के बीच एक तेज इंटरफ़ेस के रखने के लिए. आग पॉलिश विंदुक का उपयोग ढाल के शीर्ष करने के लिए कक्षों को जोड़ें, धीरे इंटरफ़ेस परेशान बिना ट्यूब के पक्ष के साथ उन्हें जोड़ने.
  4. और 1800xg पर अपकेंद्रित्र अपकेंद्रित्र में सावधानी से ट्यूब जगह. इतना है कि यह लगभग 2 मिनट लगते हैं को वांछित गति तक पहुँचने: गति एक कदम हर सेकंड 20 (लगभग 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg गति की वृद्धि इस प्रकार के रूप में कर रहे हैं) रैंप. 10 मिनट के लिए टाइमर जब 1800xg तक पहुँच जाता है शुरू करो. जब समाप्त हो, धीरे धीरे हर 20 सेकंड में कदम गति कम हो.
  5. ढाल के ऊपरी इंटरफ़ेस (बड़े glia, Purkinje कोशिकाओं, और interneurons युक्त) निकालें और त्यागने.
  6. ध्यान से 35% और 60% Percoll के बीच इंटरफेस में एक विंदुक आग पॉलिश और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए स्थानांतरण के साथ कोशिकाओं को हटाने. HBSS ग्लूकोज और inverting कई बार द्वारा मिश्रण के 3 खंडों में Resuspend. 1100xg पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
  7. निकालें सतह पर तैरनेवाला और DNase का 50 μl के साथ 10% FBS मध्यम 4 मिलीलीटर जोड़ने. गोली Resuspend धीरे आग पॉलिश विंदुक का उपयोग करने के लिए एक एकल कक्ष निलंबन के रूप में. 6.2 कदम आगे बढ़ें.

भाग 6: पूर्व चढ़ाना और चढ़ाना

  1. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और तुरंत 10% FBS मध्यम 4 मिलीलीटर में 2.4 कदम से 50 μl DNase के साथ गोली resuspend. हालांकि गंभीरता से एक नायलॉन जाल (ताकना आकार सुक्ष्ममापी 70) सेल निलंबन फ़िल्टर. यह कदम बड़े गैर neuronal कोशिकाओं को हटाने और एक बेहतर एकल कक्ष निलंबन के लिए प्रदान करता है.
  2. प्लेट एक 5% सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक पाली - डी - lysine लेपित पूर्व चढ़ाना 20 मिनट के लिए पकवान पर एकत्र कोशिकाओं. एक ताजा पकवान के साथ दोहराएँ. astroglia और भारी कोशिकाओं बसने और व्यंजन का पालन करें और छोटे ग्रेन्युल न्यूरॉन्स और न्यूरॉन पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं को अस्थायी छोड़ जाएगा. ऊष्मायन के बाद, शिथिल पालन ग्रेन्युल न्यूरॉन्स और न्यूरॉन पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं को आसानी से और उखाड़ फेंकना प्लेट के कोमल दोहन के साथ ढीला कर रहे हैं.
  3. 200xg पर 5 मिनट के लिए ग्रेन्युल और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में न्यूरॉन्स न्यूरॉन पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं लीजिए. सीरम मुक्त माध्यम के 1 मिलीलीटर में गोली Resuspend और 10 μl के एक विभाज्य एक hemocytometer का उपयोग गिनती.
  4. सीरम मुक्त माध्यम जोड़ें वांछित सेल घनत्व तक पहुँचने के लिए. 4 अच्छी तरह प्लेटें, 650.000 कोशिकाओं के लिए, 6 अच्छी तरह प्लेटें, 3,5 करने के लिए 4 मिलियन कोशिकाओं के लिए: मध्यम घनत्व के लिए थाली करने के लिए कोशिकाओं की संख्या को असहज दिशानिर्देशों. 6-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों के लिए, थाली मैं 1.5 मिलीग्राम / अच्छी तरह से और अच्छी तरह से 4 के लिए पीएलएtes, प्लेट मैं 0.5 मिलीग्राम / अच्छी तरह से. कोशिकाओं को एक 5% सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा जाता है . मध्यम बाद हर दो तीन दिन में परिवर्तन के साथ पूरी तरह से 24 घंटे बाद बदलें.

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Discussion

यह प्रोटोकॉल है कि पिछले 3,7,11 में वर्णित किया गया है प्रक्रियाओं के संशोधनों पर आधारित है . वहाँ कई महत्वपूर्ण बिंदुओं ध्यान दें के रूप में नीचे चर्चा कर रहे हैं.

ग्रेन्युल न्यूरॉन्स और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं चढ़ाना के 2 घंटे के भीतर पालन करें. स्वस्थ कोशिकाओं खुर्दबीन चरण विपरीत 4 के तहत एक दौर आकारिकी है. चढ़ाना के बाद 24 घंटे के भीतर, स्वस्थ कोशिकाओं को समान रूप से coverslips या अच्छी तरह से प्लास्टिक के आसपास फैल और प्रक्रियाओं के फार्म का होगा जाएगा. पहली मध्यम परिवर्तन के समय 24 घंटे के बाद, वहाँ कुछ मृत अस्थायी कोशिकाओं जाएगा. यह सामान्य है, के रूप में कुछ कोशिकाओं को मरने या पृथक्करण की प्रक्रिया के दौरान अस्वस्थ हो जाएगा. हालांकि, अगर 48 घंटे के बाद कोशिकाओं के साथ उनकी प्रक्रियाओं पर varicosities साथ clumped हैं, या तो कोशिकाओं अस्वस्थ हैं या पाली - डी - lysine सब्सट्रेट विषैला होता है. सबसे substrates के साथ के रूप में, पाली-D-lysine की प्रभावकारिता बहुत निर्भर है और प्रत्येक नए बहुत परीक्षण किया जाना चाहिए. स्वस्थ संस्कृतियों की छवियाँ 4,11 संदर्भ, और 20 में पाया जा सकता है . स्वस्थ कोशिकाओं संस्कृति में दो 8 सप्ताह के लिए रखा जा सकता है.

ग्रेन्युल न्यूरॉन progenitors 8,12,13,14 चढ़ाना पर अंतर शुरू करते हैं. एक बार इष्टतम चढ़ाना घनत्व अपने अध्ययन के लिए स्थापित है, यह बनाए रखा जाना चाहिए क्योंकि प्रसार पायदान 15 संकेतन जैसे कारकों द्वारा पदोन्नत किया है, और कोशिकाओं उच्च घनत्व में अधिक पैदा होगा. मध्यम 12,13,14 ध्वनि हाथी (श्श्श) जोड़कर ग्रेन्युल न्यूरॉन progenitors के प्रसार में काफी लंबे समय तक किया जा सकता है . Laminin भी पाली - डी - lysine के अलावा एक सब्सट्रेट neurite 16,17 परिणाम को बढ़ावा देने के रूप में जोड़ा जा सकता है है. ग्रेन्युल सेल संस्कृति के इन सुविधाओं को या तो ग्रेन्युल न्यूरॉन्स के जीव विज्ञान या 6,18,19 न्यूरॉन्स में progenitors कोशिकाओं के भेदभाव के विनियमन के अध्ययन के लिए एक प्रणाली प्रदान करते हैं .

प्रसव के बाद चूहों से पृथक अनुमस्तिष्क कोशिकाओं शुरू ग्रेन्युल और सेल 8 चक्र के विभिन्न चरणों में न्यूरॉन्स ग्रेन्युल न्यूरॉन progenitors के एक मिश्रण के शामिल हैं. वहाँ भी कर रहे हैं astroglia और interneurons अलगाव / संस्कृति और ग्रेन्युल न्यूरॉन्स और ग्रेन्युल progenitors (95% -99%) आगे शुद्धि Percoll ढाल 4 जुदाई से उपलब्ध हो जाता है में मौजूद है. समृद्ध ग्रेन्युल Percoll ढाल जुदाई कदम के उपयोग के बिना प्राप्त कोशिकाओं ग्रेन्युल न्यूरॉन progenitors, 18,19,20 के प्रसार और भेदभाव के विनियमन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस के मंडन में, हम Percoll ढाल जुदाई कदम श्श्श के लिए robustly कई दिनों के लिए सेल चक्र में शेष द्वारा, जवाब और श्श्श अलावा बिना कि दरकिनार द्वारा पृथक जनसंख्या में है कि कोशिकाओं को लगता है, वहाँ संस्कृतियों में बहुत कम प्रसार के रूप में संकेत दिया है सेल प्रसार निर्माता, Ki67 के साथ धुंधला हो जाना. हालांकि, अगर संस्कृतियों के लिए इन विट्रो में कई दिनों से परे इस्तेमाल हो रहे हैं, यह अनुशंसा की जाती है कि Percoll ढाल कदम को गैर neuronal कोशिकाओं proliferating द्वारा ग्रेन्युल न्यूरॉन्स के संदूषण को कम करने के लिए शामिल किया जाना है.

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Acknowledgments

हम अमूल्य सुझाव के लिए बारबरा Carletti और ​​अन्ना Marie Kenney धन्यवाद. DK07328: HYL से प्रशिक्षण अनुदान "जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान हार्मोन" द्वारा समर्थित है. NIH अनुदान 5R01 NS16951 (सीएएम) द्वारा भाग में समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell strainer with 70μm mesh pore BD Biosciences 352350
Spinal Needle BD Biosciences 405182 20G x 3-1/2 inches
Poly-D-Lysine mol wt>300,000 Sigma-Aldrich P1024 Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested.
Percoll Sigma-Aldrich P-1644
Penicillin-Streptomycin (100X) Sigma-Aldrich P4333
HBSS Invitrogen 14175-103 Must be calcium and magnesium free.
Neurobasal A-Medium Invitrogen 10888-022
Glutamax I supplement Invitrogen 35050-061
B-27 Serum Free Supplement (50x) Invitrogen 17504-044
12-mm circle coverslips Carolina Biological 63-3029 These are made in Germany by Deckgluder.
25-mm circle coverslips Carolina Biological 63-3037 These are made in Germany by Deckgluder.
Papain Dissociation System Worthington Biochemical LK 003150 Kit is good for five isolations.
Permaset scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS6782
Dumont #5 (Dumostar) Roboz Surgical Instruments Co. RS4978
4-well culture dish Nalge Nunc international 176740
6-well culture dish Nalge Nunc international 140685

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References

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तंत्रिका विज्ञान 23 अंक सेरिबैलम अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन progenitors अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स बाहरी ग्रेन्युल परत संस्कृति सेल शुद्धि
अलगाव और प्रसवोत्तर माउस अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और न्यूरॉन्स की संस्कृति
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Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. … More

Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons . J. Vis. Exp. (23), e990, doi:10.3791/990 (2009).

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