Isolierung und Kultivierung von Post-Natal-Maus Cerebellar Granule Neuron Vorläuferzellen und Neuronen

Summary

Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung und Kultur des Kleinhirns Granulat Neuron Vorläuferzellen und Kleinhirn Nervenzellen Granulat aus postnatalen Maus.

Abstract

Die Kleinhirnrinde ist eine gut beschriebene Struktur, einzigartige Möglichkeiten zur Untersuchung neuronaler Eigenschaften und Entwicklung ^1,2 bietet. Von den Kleinhirn-Neuronen-Typen (Körnerzellen, Purkinje-Zellen und hemmenden Interneuronen), sind Nervenzellen Granulat bei weitem die meisten und sind die am häufigsten vorkommende Art von Neuronen im Gehirn von Säugetieren. Bei Nagetieren sind zerebelläre Nervenzellen Granulat während der ersten zwei postnatalen Wochen von Vorläuferzellen in der äußersten Schicht der Kleinhirnrinde, die externen Körnerschicht (EGL) generiert. Das Protokoll hier vorgestellten beschreibt Techniken zu bereichern und Kultur Granulat Neuronen und ihre Vorläuferzellen aus postnatalen Maus Kleinhirn. Wir beschreiben Verfahren Kulturen von zunehmender Reinheit ^3,4, die verwendet werden, um die Differenzierung von proliferierenden Vorläuferzellen in Nervenzellen Granulat ^5,6-Studie zu erwirken. Sobald die Vorläuferzellen zu differenzieren, die Kulturen auch eine homogene Population von Nervenzellen Granulat für experimentelle Manipulation und Charakterisierung von Phänomenen wie Synaptogenese, Glutamat-Rezeptor-Funktion ^7, Interaktion mit anderen gereinigt Kleinhirn Zellen ^8,9 oder Zelle Death ^7.

Protocol

Teil 1: Einrichten (1-2 Tage vor Dissektion) (Nicht auf Video gezeigt)

1. VORBEREITUNG Nährlösungen und Medien:
   • 4X CMF-PBS-EDTA (Calcium und Magnesium free-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung-EDTA für Percoll Verdünnungen): pro Liter, fügen Sie 32 g NaCl, 1,2 g KCl, 8 g Glucose, 2 g NaH ₂ PO _4, 1 g KH ₂ PO _4, 8 ml 2% NaHCO ₃ Lager, 10 ml 1M EDTA (pH 8,0) zu destilliertem / deionisiertem Wasser. Stellen Sie die Lautstärke auf 1 Liter und der pH-Wert auf 7,4. Filter sterilisieren.
   • HBSS-GLUCOSE: Add Glukose (6 Gramm / Liter), um Calcium und Magnesium freie Hanks Bilanz Salt Solution (HBSS) und Sterilfilter. 500 ml bei 4 ° C gelagert werden bis zu einem Monat.
   • KULTUR MEDIA: serum-freiem Medium (SFM) und 10% FBS-Medium. Um 48 ml Neurobasal A-Medium hinzufügen, 500 ul 100X Glutamax I, 500 ul 100X Penicillin-Streptomycin (final 100 Einheiten Penicillin und 100 ug Streptomycin), 6,25 ul 2 M KCl (final 250 uM). Split in 2 Aliquots von 9 ml und 40 ml. Zur Vorbereitung 10% FBS-Medium, 1ml von hitzeinaktiviertem FBS auf die 9 ml Aliquot. Zur Vorbereitung SFM, fügen Sie 800 ul des Serum-freien Ergänzung B-27 auf die 40 ml Aliquot. Filter sterilisiert und bei 4 ° C für maximal 2 Wochen. Für beste Ergebnisse zu frischem Medium für jedes Experiment.
2. VORBEREITUNG PERCOLL Verdünnungen:
   • Percoll wird als Flüssigkeit geliefert und muss vor Gebrauch angesäuert werden. Zur Vorbereitung der Lager, fügen 1N HCl nach und nach zu der Percoll-Lösung über einen Zeitraum von 1-2 Stunden, bis pH 7,4 erreicht ist. Hinzufügen des HCl zu schnell bewirkt, dass der Percoll zu aggregieren. Etwa 6.5ml 1N HCl werden für jeden Liter Percoll benötigt. Filter sterilisiert und bei 4 ° C.
   • A 35% und 60% (vol: vol) Percoll Verdünnung wird in die Percoll-Gradienten Schritt verwendet werden. Es werden 100 ml Percoll Verdünnungen mit 35 oder 60 ml Percoll Lager, 25 ml von 4X CMF-PBS-EDTA und destilliertem / deionisiertem H2O auf das Endvolumen. Fügen Sie ein paar Tropfen Toluidinblau, die 60% ige Lösung, es wird dazu beitragen, visualisieren die Schnittstelle und die Zellen. Filter sterilisiert und bei 4 ° C.
   • 4X CMF-PBS-EDTA sollten nicht älter als 3 Monate, als unzureichend Pufferung erhöht Zelltod während des Verfahrens führen.
3. VORBEREITUNG Deckgläser: Deckgläser (am besten, wenn von Carolina Biological Supply Company) werden mit 10% HCl über Nacht bei Raumtemperatur mit leichtem Rühren gewaschen, gespült gründlich mit destilliertem / deionisiertem Wasser und in 70% Ethanol. Vor der Anwendung werden einzelne Deckgläser Flamme sterilisiert, indem Sie kurz hielt sie mit einer Pinzette über einer offenen Flamme (Bunsenbrenner), bis das Ethanol verdampft. 12-mm Deckgläschen kann in 4-well-Platten und 25-mm-Deckgläschen in 6-well-Platten gelegt werden.
4. COATING Kulturgefäße mit Substrat: Für Immunfluoreszenzfärbung oder medikamentöse Behandlungen Deckgläser sind besser geeignet, da sie leicht auf Glasobjektträger für die Visualisierung unter dem Mikroskop montiert werden. Wenn eine große Anzahl von Zellen für die Erfassung Protein oder RNA-Proben werden benötigt, Zellen auf Kunststoff-Kultur kultiviert werden dishes.The Nacht vor ihrer Zerlegung, muss Deckgläser oder Plastikschalen für Kultur mit Poly-D-Lysin (500 ug / ml beschichtet werden; 800 ul / well für 6-Well-Platten oder 350 ul / well für 4-Well-Platten). 5 mg / ml Stammlösung von Poly-D-Lysin wird bei -20 ° C, dann in sterilem destilliertem / deionisiertem Wasser und sterilfiltriert Recht vor Gebrauch verdünnt gespeichert. Kultur Schiffe sind bei 37 ° C über Nacht (oder mindestens 2 Stunden vor dem Ausplattieren) und zweimal mit sterilem destilliertem / deionisiertem Wasser direkt vor dem Beschichten.
5. VORBEREITUNG PREPLATING GERICHTE: Diese Gerichte werden für Vor-Vernickelung der isolierten Kleinhirn Zellen vor Kultur Gliazellen Verunreinigungen, die eher auf eine niedrigere Konzentration von Substrat haften zu entfernen, um verwendet werden. Coat zwei 60-mm Kunststoff-Petrischalen mit 4 ml pro Schale aus Poly-D-Lysin (100 ug / ml; Hinweis: Dies ist 1 / 5 der Konzentration für die Kultivierung verwendet). Bei 37 ° C über Nacht (oder mindestens 2 Stunden vor ihrer Zerlegung). Kurz vor der Dissektion, entfernen Sie die Poly-D-Lysin-Lösung, das Geschirr abwaschen zweimal mit sterilem Wasser und lassen Sie sie in die Haube zu trocknen.
6. Sterilisieren Dissektion Werkzeuge im Autoklaven oder am Tag der Dissektion, tauchen die Werkzeuge in 70% Ethanol für 20 Minuten. Benötigtes Werkzeug: Permaset Schere, Schere microdissecting, vier Dumont Nr. 5 Pinzette.

Teil 2: Vorbereitungen für Dissection (Tag der Dissektion) - (demonstriert im Video)

Alle der folgenden Verfahren werden in einer Gewebekultur Abzug durchgeführt, sofern nicht anders.

1. Wischen Sie die Sezieren Bereich mit 70% Ethanol. Warm den Medien bis 37 ° C im Wasserbad oder in einem 5% CO ₂ 37 ° C Inkubator.
2. Beim Start einer neuen Papain Dissoziation System Kit (Worthington), bereiten die Lösung von Albumin-Ovomucoid-Hemmer. Fügen Sie 32 mlvon EBSS (Earle Balanced Salt Solution, vorausgesetzt, in dem Kit) an das Albumin-Ovomucoid Inhibitor-Mischung und lassen Sie den Inhalt zu lösen, während der Vorbereitung der anderen Komponenten. Bereiten Sie für den ersten Einsatz, dann speichern Sie die verbleibende Lösung bei 2-8 ° C und verwenden, bis die fünf Isolierungen von jedem Kit erlaubt abgeschlossen sind.
3. 5 ml EBSS zu einem Papain Fläschchen aus der Dissoziation Kit (jedes Fläschchen ist ausreichend für die Dissoziation von 4 bis 15 cerebella von postnatalen Tag 5 Mäuse). Legen Sie die Papain Fläschchen in einem 5% CO ₂ 37 ° C Inkubator oder 37 ° C Wasserbad für 5 bis 10 Minuten, bis die Papain vollständig gelöst und die Lösung klar erscheint. Pflegen Sie die Lösung bei Raumtemperatur während der Präparation.
4. Add 500 ul EBSS eine DNase Fläschchen aus der Dissoziation Kit. Vorsichtig mischen, indem Sie die Flasche seit DNase ist scherempfindlichen Denaturierung. Add 250 ul dieser Lösung in die Durchstechflasche mit dem Papain (Endkonzentration 20 Einheiten / ml Papain und 0,005% DNase). Speichern Sie die verbleibenden DNase Fläschchen für den Einsatz in Schritt 5.1 oder 6.1.

Teil 3: Dissection und Hirnhäute Removal

1. Das optimale Alter für Granulat Zellkultur von C57BL/6J-Mäuse ist postnatalen Tag 4-6, wenn die Anzahl der Körnerzellen Vorfahren in der EGL peaks1, 10. Dissect Welpen ein zu einer Zeit und wie Sie besser mit den Kleinhirn-Dissektion werden versuchen, Dissektion Zeit, um nicht mehr als 6 Minuten pro Welpe zu reduzieren. Die Geschwindigkeit ist von fundamentaler Bedeutung.
   Wenn der Percoll-Gradienten Schritt umgangen wird, können bis zu acht postnatalen Tag-5-Maus Welpen genügend Zellen für eine 6-well-Kulturplatte (oder sechs 25-mm-Deckgläser) oder für sechs 4-well-Platten (oder 24 12 RENDITEOPT - mm Deckgläschen). Ungefähre Kapazität beträgt 4 bis 5x106 Zellen pro Welpe und Galvanisieren Dichten kann zwischen 1 und 5x105 Zellen/cm2 Bereich. Da 15-20% Zellen während der Percoll step4 verloren gehen, werden mehr Tiere benötigt, um die gleiche gewünschte Zelldichte zu erhalten.
2. Pipette 15 ml HBSS-Glucose in einer 60-mm Kunststoff-Gewebe Kulturschale und 10 ml in ein steriles Falcon 15 ml konische Kunststoffrohr. Auf Eis gelegt.
3. Außerhalb der Haube, wischen den Kopf des Welpen mit 70% Ethanol. Verwenden Sie Permaset Schere, um die Welpen zu enthaupten. (Enthauptung wird nicht in dem Video zu sehen sein.)
4. In der Haube, halten Sie den Kopf mit einer Pinzette Dumont, so dass man deutlich sehen kann die Rückseite des Schädels. Besuchen Sie das Gehirn, indem Sie microdissecting Schere in das Foramen magnum und Schneiden direkt auf die Augen. Mit einer Pinzette, ziehen Sie die Haut und heben Sie den Schädel in das Gehirn freizulegen. Mit Dumont Pinzetten, kneifen Sie das Kleinhirn und die umliegenden Mittelhirn und überträgt es auf die Schale mit HBSS-Glucose. (Es ist einfacher, das Kleinhirn zu manipulieren und entfernen Sie die Hirnhäute, wenn das Kleinhirn noch an das umliegende Gewebe im Anhang).
5. Unter dem Binokular vorsichtig schälen Meningen aus dem Kleinhirn und auch zwischen den Lappen mit einer feinen Pinzette Dumont Nr. 5, während mit der anderen Pinzette zu verankern sich das Kleinhirn auf die Platte. Sie werden die Blutgefäße auf der Oberfläche des Kleinhirns kündigen. Diese Blutgefäße sind ein guter Weg, um die Meningen zu identifizieren. Entfernen Sie die Hirnhäute, bis das Kleinhirn nimmt eine verfilzte weißes Aussehen. Separate das Kleinhirn vom Rest des Mittelhirns. Schalten sie ihre Bauchseite und entfernen Sie den Plexus, die wie ein rötliches Band zwischen dem ventralen Kleinhirn und den angrenzenden Mittelhirn aussieht. Platzieren Sie jede Kleinhirn in kaltem HBSS-Glucose in einem 15 ml konischen Röhrchen auf Eis so schnell wie seziert. Ändern Sie den Sezieren Lösung an die frische HBSS-Glucose nach Sezieren 3 Gehirne.

Teil 4: Die Zellsuspension

1. Nachdem alle Sektionen fertig sind, entfernen Sie die HBSS-Glucose aus der Tube und ersetzen Sie es mit dem Papain-Lösung in Schritt 2.4 gemacht. Obwohl das Kit empfiehlt Schneiden des Gewebes in kleine Stücke, so finden wir, dass es nicht notwendig ist, schneiden oder hacken cerebella in diesem Alter. Legen Sie das Gewebe + Papain-Lösung (in einem 15 ml konischen Rohr) in einem 37 ° C Wasserbad oder 5% CO ₂ 37 ° C Inkubator für 15 bis 20 Minuten. Für 4 bis 8 cerebella, 15 Minuten bei 37 ° C ausreichend ist, für eine größere Anzahl von cerebella 20 bis 30 Minuten ist besser. Vorsichtig geschwenkt, das Rohr alle 3 bis 4 Minuten.
2. Man reibt die Mischung mit einem sterilen p1000 Aerosol Pipettenspitze, die mit FBS beschichtet wurde. Führen Sie diesen Schritt sanft, um die Luft Blasenbildung zu verhindern. Feuerpolierte Glaspipetten kann verwendet werden, aber wir finden, dass das Serum beschichteten sterilen p1000 Aerosol Tipps genauso gut funktionieren. Zur Beschichtung der Pipettenspitze mit FBS, Pipette FBS nach oben und unten zweimal kurz vor dem Gebrauch. Etwa 10 Auf-und Abbewegungen mit der Pipette sind genug, um das Gewebe zu distanzieren. Die Lösung wird trüb. Lassen Sie die Suspension für 30-60 Sekunden so sitzen, dass jede große Stücke von undissoziierten Gewebe wird auf den Boden des Röhrchens absetzen.
3. Entfernen Sie die suspendierten Zellen (Achten Sie darauf, die undissoziierten Gewebestücke in der b entfernenottom) in ein frisches 15 ml konische Röhrchen mit einem Serum-beschichteten Pipettenspitze. Zentrifuge bei etwa 200xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Bereiten Resuspension Medium. Um dies zu tun, mischen 2,7 ml EBSS mit 300 ul rekonstituierte Albumin-Ovomucoid Inhibitor-Lösung in einem sterilen Röhrchen. Add 150 ul DNase-Lösung aus Schritt 2.4.
4. Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und sofort Zellpellet in die verdünnte DNase / Albumin-Inhibitor-Lösung in Schritt 4.3 mit einem Serum-beschichteten p1000 Aerosol Pipettenspitze vorbereitet.
5. Bereiten Sie einen diskontinuierlichen Dichtegradienten wie folgt. 5 ml Albumin-Ovomucoid Inhibitor-Lösung in ein 15 ml konischen Rohr. Sorgfältig Schicht der Zellsuspension an der Spitze. Zentrifuge bei etwa 70xg für 6 Minuten bei Raumtemperatur. Dissoziierten Zellen Pellet am Boden des Röhrchens, bleiben Membranfragmente an der Grenzfläche.
6. Wenn Sie Kulturen, die in Körnerzellen angereichert sind erhalten wollen, Bypass der Percoll-Gradienten Trennschritt (die Erträge reiner Kulturen des Kleinhirns Körnerzellen), und fahren Sie mit Teil 6. Wenn Sie weitere Isolierung der Körnerzellen aus Glia und große Interneuronen durch Percoll-Gradienten Trennung wünschen, Teil 5 fortfahren. Die Nutzung der Percoll-Gradienten Schritt verringert sich die Ausbeute der Zellen. In unsere Hände ist die Verminderung der Ausbeute ca. 20-35%. Es gibt jedoch eine Erhöhung der Anreicherung von Nervenzellen Granulat-und Vorläuferzellen aus ca. 90% auf 95-99%.

Teil 5: Percoll Gradient Separation

1. Überstand verwerfen und sofort das Pellet in 2 ml HBSS-Glucose mit 50 ul DNase aus Schritt 2.4. Filtern Sie die Zellsuspension obwohl ein Nylonnetz (Porengröße 70 um) durch die Schwerkraft. Dieser Schritt wird zu entfernen große nicht-neuronalen Zellen und sorgt für eine bessere einzigen Zellsuspension.
2. Bereiten Sie zwei Feuer-poliertem Glas Pasteur Pipetten. Um dies zu tun, sanft Flamme der Spitze einer Glaspipette, bis die Kante geglättet wird und die Pipette Bohrung beträgt 40-50% der ursprünglichen Größe. Achten Sie darauf, um die Öffnung zu klein.
3. Bereiten Percoll-Gradienten. 10 ml 35% Percoll-Lösung in einem 50 ml sterile konischen Rohr. 60% Percoll (10 ml) wird in eine 10 ml sterile Spritze mit einer sterilen Nadel Wirbelsäule belastet. Vorsichtig Schicht der 60% Percoll-Lösung unter der 35% ige Lösung, indem Sie die 60% ige Lösung an der Unterseite des Rohres mit dem Spinalnadel. Achten Sie darauf, halten eine scharfe Grenzfläche zwischen den beiden Schichten. Fügen Sie die Zellen an die Spitze des Gradienten mit einem feuerpolierte Pipette vorsichtig indem Sie sie entlang der Seite des Rohres, ohne die Oberfläche.
4. Legen Sie das Rohr in der Zentrifuge und Zentrifuge bei 1800xg. Ramp up der Geschwindigkeit einen Schritt alle 20 Sekunden (in Schritten von Geschwindigkeit sind wie folgt: ca. 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg), so dass es dauert ca. 2 Minuten auf die gewünschte Geschwindigkeit zu erreichen. Starten Sie den Timer bis 10 min bei 1800xg erreicht wird. Wenn Sie fertig sind, verringern Geschwindigkeit allmählich einen Schritt alle 20 Sekunden.
5. Entfernen Sie die obere Schnittstelle des Gradienten (mit großen Glia, Purkinje-Zellen und Interneuronen) und entsorgen.
6. Entfernen Sie vorsichtig die Zellen an der Schnittstelle zwischen 35% und 60% Percoll mit einer feuerpolierte Pipette aufnehmen und in 50 ml konischen Rohr. Resuspendieren in 3 Bänden von HBSS-Glucose und mischen durch mehrmaliges Wenden. Zentrifugieren Sie für 5 Minuten bei 1100xg.
7. Entfernen Sie den Überstand und 4 ml 10% FBS-Medium mit 50 ul DNase. Das Pellet vorsichtig mit einem feuerpolierte Pipette auf eine einzelne Zelle Suspension bilden. Gehen Sie auf 6,2 Schritt.

Teil 6: Pre-Beschichtung und Plating

1. Überstand verwerfen und sofort das Pellet in 4 ml 10% FBS-Medium mit 50 ul DNase aus Schritt 2.4. Filtern Sie die Zellsuspension obwohl ein Nylonnetz (Porengröße 70 um) durch die Schwerkraft. Dieser Schritt wird zu entfernen große nicht-neuronalen Zellen und sorgt für eine bessere einzigen Zellsuspension.
2. Platte die gesammelten Zellen auf Poly-D-Lysin beschichteten pre-Plating-Schüssel für 20 Minuten in einem 5% CO ₂ 37 ° C Inkubator. Wiederholen Sie mit einem frischen Teller. Die Astroglia und schwerere Zellen niederlassen und sich an die Gerichte und lassen Sie die kleinen Körnchen Neuronen und neuronalen Vorläuferzellen zu schweben. Nach der Inkubation werden locker eingehalten Granulat Neuronen und neuronalen Vorläuferzellen lösen sich leicht und aufgelockert mit leichtes Ausschlagen der Platte.
3. Sammeln Sie die Nervenzellen Granulat und Neuron Vorläuferzellen in einem 15 ml konischen Rohr und Zentrifuge bei 200xg für 5 Minuten. Das Pellet in 1 ml Serum-freiem Medium und zählen ein Aliquot von 10 ul mit einer Zählkammer.
4. Add serum-freiem Medium auf die gewünschte Zelldichte erreicht. Grobe Richtlinien, die Zahl der Zellen, die Platte für mittlere Dichte: für 6-Well-Platten, 3,5 bis 4.000.000 Zellen; für 4-Well-Platten, 650.000 Zellen. Für 6-well-Platten, I Platte 1,5 ml / well und für 4 gut plates, I mit 0,5 ml / well. Die Zellen werden in einem 5% CO ₂ 37 ° C Inkubator gepflegt. Ändern Sie das Medium komplett 24 Stunden später mit späteren Änderungen jeder zwei vor drei Tagen.

Discussion

Dieses Protokoll basiert auf Modifikationen der Verfahren, die in der Vergangenheit ^3,7,11 beschrieben worden sind, basiert. Es gibt einige wichtige Punkte zu beachten wie unten diskutiert.

Die Nervenzellen Granulat-und Vorläuferzellen innerhalb von 2 Stunden plating halten. Gesunde Zellen haben einen runden Morphologie unter dem Phasenkontrast-Mikroskop ^4. Innerhalb von 24 Stunden nach dem Ausplattieren werden gesunde Zellen gleichmäßig verteilt auf der ganzen Deckgläser oder der Kunststoff gut und Prozesse bilden. Zum Zeitpunkt des ersten Mediums ändern, nach 24 Stunden, wird es ein paar tote schwimmenden Zellen. Das ist normal, da ein paar Zellen sterben oder ungesund geworden während der Dissoziation. Allerdings, wenn nach 48 Stunden wurden die Zellen mit Krampfadern auf ihre Prozesse verklumpt sind, entweder die Zellen sind ungesund oder das Poly-D-Lysin-Substrat ist giftig. Wie bei den meisten Substraten ist die Wirksamkeit von Poly-D-Lysin viel abhängiger und jeder neuen Charge getestet werden müssen. Bilder von gesunden Kulturen in Verweise ^{4,11 und 20} gefunden werden. Gesunde Zellen können in Kultur gehalten werden bis zu zwei Wochen ^8.

Granule Neuron Vorläuferzellen beginnt nach plating ^8,12,13,14 unterscheiden. Sobald die optimalen Beschichtungs-Dichte für Ihr Studium aufgebaut ist, sollte sie aufrechterhalten werden, weil die Verbreitung von Faktoren wie Notch ¹⁵ gefördert wird, und die Zellen vermehren sich mehr bei höheren Dichten. Die Verbreitung von Granulat Neuron Vorläuferzellen erheblich, indem Sonic Hedgehog (SHH) auf das Medium ^12,13,14 verlängert werden. Laminin ist auch als Substrat neben poly-D-Lysin, um Neuritenwachstum ^16,17 fördern hinzugefügt werden. Diese Eigenschaften des Granulats Zellkultur bieten ein System für das Studium entweder die Biologie der Nervenzellen Granulat oder die Regulierung der Differenzierung von Vorläuferzellen zu Nervenzellen ^6,18,19.

Isolierte Kleinhirn Zellen aus postnatalen Mäusen werden zunächst aus einer Mischung von Nervenzellen Granulat und Granulat Neuron Vorläuferzellen in verschiedenen Stadien der Zelle Zyklus ⁸ zusammen. Es gibt auch Astroglia und Interneuronen in der Isolation / Kultur und weiteren Reinigung der Nervenzellen Granulat und Granulat Vorläuferzellen (95% -99%) wird durch die Percoll-Gradienten Trennung ⁴ erreicht. Angereichert Körnerzellen ohne den Einsatz des Percoll-Gradienten Trennung Schritt erhalten wurden verwendet, um die Regulation der Proliferation und Differenzierung von Granulat Neuron Vorläuferzellen, ^18,19,20 studieren. In Bestätigung dieser, wir, die Zellen zu finden in der Bevölkerung unter Umgehung des Percoll-Gradienten Trennschritt robust reagieren Shh bei Verbleiben in den Zellzyklus für mehrere Tage, und das ohne Shh zusätzlich isoliert, es gibt sehr wenig Verbreitung in den Kulturen wie angegeben durch Färbung mit der Zellproliferation maker, Ki67. Allerdings, wenn die Kulturen, über mehrere Tage in vitro verwendet werden sollen, empfiehlt es sich, dass die Percoll-Gradienten Schritt enthalten, um eine Verunreinigung des Granulats Neuronen durch wuchernde nicht-neuronalen Zellen zu verringern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell strainer with 70μm mesh pore	BD Biosciences	352350
Spinal Needle	BD Biosciences	405182	20G x 3-1/2 inches
Poly-D-Lysine mol wt>300,000	Sigma-Aldrich	P1024	Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested.
Percoll	Sigma-Aldrich	P-1644
Penicillin-Streptomycin (100X)	Sigma-Aldrich	P4333
HBSS	Invitrogen	14175-103	Must be calcium and magnesium free.
Neurobasal A-Medium	Invitrogen	10888-022
Glutamax I supplement	Invitrogen	35050-061
B-27 Serum Free Supplement (50x)	Invitrogen	17504-044
12-mm circle coverslips	Carolina Biological	63-3029	These are made in Germany by Deckgluder.
25-mm circle coverslips	Carolina Biological	63-3037	These are made in Germany by Deckgluder.
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical	LK 003150	Kit is good for five isolations.
Permaset scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS6782
Dumont #5 (Dumostar)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS4978
4-well culture dish	Nalge Nunc international	176740
6-well culture dish	Nalge Nunc international	140685