Isolatie en Cultuur van Post-Natal Mouse Cerebellaire Korrel Neuron progenitor cellen en Neuronen

Summary

Hier presenteren wij een methode om te isoleren en cultuur cerebellaire granule neuron progenitor cellen en cerebellaire korrel neuronen van postnatale muis.

Abstract

De cerebellaire cortex is een goed beschreven structuur die unieke kansen voor het bestuderen van neuronale eigenschappen en ontwikkeling ^1,2 biedt. Van de cerebellaire neuronale types (granule cellen, Purkinje cellen en remmende interneuronen), granulaat neuronen zijn veruit de meest talrijke en zijn de meest voorkomende vorm van neuronen in de hersenen van zoogdieren. Bij knaagdieren, zijn de kleine hersenen korrel neuronen die tijdens de eerste twee postnatale week van progenitor cellen in de buitenste laag van de cerebellaire cortex, de externe korrel laag (EGL). Het protocol beschrijft hier gepresenteerde technieken te verrijken en cultuur korrel neuronen en hun stamcellen uit post-natale muis cerebellum. We beschrijven de procedures aan culturen van toenemende zuiverheid ^3,4, die kan worden gebruikt om de differentiatie van prolifererende progenitorcellen in de granule neuronen ^5,6 studie te verkrijgen. Zodra de progenitor cellen differentiëren, de culturen ook een homogene populatie van korrel neuronen zorgen voor experimentele manipulatie en karakterisering van fenomenen zoals synaptogenese, glutamaat receptor functie ^7, interactie met andere gezuiverde cerebellaire cellen ^8,9 of celdood ^7.

Protocol

Deel 1: Het opzetten van (1-2 dagen vóór versnijding) (niet getoond op de video)

1. VOORBEREIDEN CULTUUR OPLOSSINGEN EN MEDIA:
   • 4X CMF-PBS-EDTA (calcium en magnesium vrij-fosfaat gebufferde zoutoplossing-EDTA voor Percoll verdunningen): per liter, voeg 32 g NaCl, 1,2 g KCl, 8 g glucose, 2 g NaH ₂ PO _4, 1 g KH ₂ PO _4, 8 ml 2% NaHCO ₃ voorraad, 10 ml 1 M EDTA (pH 8,0) om gedestilleerd / gedemineraliseerd water. Zet het volume op 1 liter en de pH op 7,4. Filter steriliseren.
   • HBSS-GLUCOSE: Voeg glucose (6 gram / liter) voor calcium en magnesium vrij Hank's Balance Salt Solution (HBSS) en steriele filter. 500 ml kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal een maand.
   • CULTUUR MEDIA: serum-vrij medium (SFM) en 10% FBS medium. Tot 48 ml van Neurobasal A-Medium toe te voegen 500 pi 100X Glutamax I, 500 ul 100X penicilline-streptomycine (finale 100 eenheden penicilline en streptomycine 100 ug), 6,25 ui 2 M KCl (laatste 250 uM). Gesplitst in twee porties van 9 ml en 40 ml. Ter voorbereiding 10% FBS medium, voeg 1 ml van hitte-geïnactiveerd FBS om de 9 ml aliquot deel. Ter voorbereiding SFM, voeg 800 ul van de serum-vrij aan te vullen B-27 naar de 40 ml aliquot deel. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 2 weken. Voor het beste resultaat te maken vers medium voor elk experiment.
2. VOORBEREIDEN Percoll verdunningen:
   • Percoll wordt geleverd als een vloeistof en het moet aangezuurd voor gebruik. Ter voorbereiding op de voorraad, voeg 1 N HCl beetje bij beetje aan de Percoll oplossing over een 1-2 uur tijd tot een pH van 7,4 is bereikt. Het toevoegen van de HCl te snel zal leiden tot de Percoll te aggregeren. Ongeveer 6.5ml van 1 N HCl nodig zijn voor elke liter van Percoll. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C.
   • Een 35% en 60% (vol: vol) Percoll verwatering zal worden gebruikt in de Percoll verloop stap. Bereiding van 100 ml Percoll verdunningen met 35 of 60 ml van Percoll voorraad, 25 ml 4X CMF-PBS-EDTA en gedestilleerd / gedeïoniseerd H2O aan de uiteindelijke volume. Voeg een paar druppels toluidine blauw aan de 60%-oplossing, het zal helpen visualiseren van de interface en de cellen. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C.
   • 4X CMF-PBS-EDTA mag niet ouder zijn dan drie maanden, als onvoldoende buffering zal worden met meer celdood veroorzaken tijdens de procedure.
3. VOORBEREIDEN coverslips: Glazen dekglaasjes (beter als van Carolina Biologische Supply Company) zijn gewassen met 10% HCl 's nachts bij kamertemperatuur met een lichte agitatie, gespoeld grondig met gedestilleerd / deonized water en opgeslagen in 70% ethanol. Voor het gebruik, enkele dekglaasjes worden vlam-gesteriliseerd door kort houdt ze met een pincet boven een open vlam (bunsenbrander) tot de ethanol verdampt. 12-mm glas dekglaasjes kan geplaatst worden in 4-putjes en 25-mm dekglaasjes in 6-putjes.
4. COATING kweekvaten met substraat: Voor immunofluorescentiekleuring of behandeling met medicijnen dekglaasjes meer geschikt zijn omdat zij gemakkelijk kunnen worden gemonteerd op glazen objectglaasjes voor visualisatie onder een microscoop. Wanneer grote aantallen cellen zijn nodig voor het verzamelen van eiwit-of RNA-monsters, cellen kunnen worden gekweekt op plastic cultuur dishes.The avond vóór versnijding, moet dekglaasjes of plastic schotels voor cultuur worden bekleed met poly-D-lysine (500 ug / ml; 800 ul / putje voor 6-well platen of 350 ul / putje voor 4-wells platen). 5 mg / ml stockoplossing van poly-D-lysine is opgeslagen bij -20 ° C, vervolgens verdund in steriel gedistilleerd / deonized water en steriel gefilterd vlak voor gebruik. Kweekvaten worden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende de nacht (of in ieder geval voor 2 uur voor plating) en tweemaal gewassen met steriel gedistilleerd / deonized water vlak voor plating.
5. VOORBEREIDEN PREPLATING GERECHTEN: Deze gerechten zullen worden gebruikt voor pre-plating de geïsoleerde cerebellaire cellen voordat cultuur gliale verontreinigende stoffen, die gemakkelijker zich te houden aan een lagere concentratie van substraat te verwijderen. Jas twee 60-mm kunststof cultuur gerechten met 4 ml per gerecht van poly-D-lysine (100 ug / ml; Merk op dat dit is 1 / 5 van de gebruikte concentratie voor het kweken van). Incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht (of in ieder geval voor 2 uur voor dissectie). Vlak voor de dissectie, verwijder de poly-D-lysine oplossing, twee keer de afwas met steriel water en laten drogen in de motorkap.
6. Steriliseer dissectie-instrumenten in de autoclaaf of op de dag van de dissectie, dompel de tools in 70% ethanol gedurende 20 minuten. Benodigd gereedschap: Permaset schaar, microdissecting schaar, vier Dumont # 5 ontleden tang.

Deel 2: Voorbereiding op Dissectie (dag van de dissectie) - (aangetoond in video)

Alle van de volgende procedures worden uitgevoerd in een weefselkweek kap, tenzij vermeld.

1. Veeg de ontleden gebied met 70% ethanol. Warm de media tot 37 ° C in een waterbad of in een 5% CO ₂ 37 ° C incubator.
2. Bij het starten van een nieuw Papaïne Dissociatie System Kit (Worthington), de voorbereiding van de oplossing van albumine-ovomucoid remmer. Voeg 32 mlvan EBSS (Balanced Salt Solution Earle's, die in de kit) om de albumine-ovomucoid remmer mengsel en laat de inhoud op te lossen, terwijl de voorbereiding van de andere componenten. Reconstitueer voor het eerste gebruik, bewaar de resterende oplossing bij 2-8 ° C en gebruiken totdat de vijf isolaties toegestaan ​​door elke kit zijn voltooid.
3. Voeg 5 ml EBSS om een ​​papaïne injectieflacon uit de Dissociation Kit (iedere flacon is voldoende voor dissociatie van 4 tot 15 cerebella van postnatale dag 5 muizen). Plaats de papaïne flacon in een 5% CO ₂ 37 ° C incubator of 37 ° C waterbad gedurende 5 tot 10 minuten tot de papaïne helemaal is opgelost en de oplossing blijkt duidelijk. Handhaaf de oplossing bij kamertemperatuur gedurende dissectie.
4. Voeg 500 ul van EBSS om een ​​DNase injectieflacon uit de Dissociatie Kit. Meng voorzichtig door te tikken op de flacon, omdat DNase is gevoelig voor afschuiving denaturatie. Voeg 250 ul van deze oplossing aan de flacon met de papaïne (uiteindelijke concentratie is 20 eenheden / ml papaïne en 0,005% DNase). Sla de resterende DNase flacon voor gebruik in stap 5.1 of 6.1.

Deel 3: Dissection en de hersenvliezen verwijderen

1. De optimale leeftijd voor korrel celkweek van C57BL/6J muizen is postnatale dag 4-6, toen het aantal korrel cel voorlopercellen in de EGL peaks1, 10. Ontleden pups een voor een en als je meer bekend raakt met de cerebellaire dissectie proberen dissectie tijd te verlagen tot niet meer dan 6 minuten per pup. Snelheid is van essentieel belang.
   Als de Percoll gradiënt stap is overgeslagen, kan acht postnatale-dagen-5 muis pups opbrengst genoeg cellen voor een 6-well plaat cultuur (of zes 25-mm dekglaasjes) of voor zes 4-putjes (of vierentwintig 12 - mm coverslips). Geschatte opbrengst is van 4 tot 5x106 cellen per pup en beplating dichtheden kan variëren tussen de 1 en 5X105 cells/cm2. Omdat 15-20% cellen verloren zijn gegaan tijdens de Percoll step4, zijn meer dieren nodig om hetzelfde gewenste cel dichtheid te verkrijgen.
2. Pipetteer 15 ml van HBSS-glucose in een 60-mm kunststof weefselkweek schotel en 10 ml in een steriele Falcon 15 ml conische plastic buis. Leg op het ijs.
3. Buiten de kap, veeg de kop van de pup met 70% ethanol. Gebruik Permaset schaar om de pup onthoofden. (Decapitation zal niet worden getoond in de video.)
4. In de kap, houdt het hoofd met Dumont tang zodat u duidelijk de achterkant van de schedel. Toegang tot de hersenen door het invoegen van microdissecting schaar in het foramen magnum en dwars in de richting van de ogen. Met behulp van een tang, afpellen van de huid en til de schedel naar de hersenen bloot te leggen. Met behulp van Dumont tang, knijp uit het cerebellum en de omliggende middenhersenen en overbrengen naar het gerecht met HBSS-glucose. (Het is gemakkelijker om de kleine hersenen te manipuleren en de hersenvliezen te verwijderen als de kleine hersenen is nog aan het omliggende weefsel).
5. Onder de microscoop ontleden, voorzichtig pellen van de hersenvliezen uit het cerebellum en ook tussen de lobben met een fijne Dumont # 5 tang, terwijl met de andere tang te verankeren beneden de kleine hersenen op de plaat. Je zal merken bloedvaten op het oppervlak van het cerebellum. Deze bloedvaten zijn een goede manier om de hersenvliezen te identificeren. Verwijder de hersenvliezen totdat het cerebellum krijgt een matte witte verschijning. Scheid de kleine hersenen van de rest van de middenhersenen. Draai het om zijn buikzijde en verwijder de choroidea plexus, die eruitziet als een rode lint tussen de ventrale cerebellum en de aangrenzende middenhersenen. Plaats elke cerebellum in koud HBSS-glucose in een 15 ml conische buis op ijs zo snel ontleed. Wijzig de ontleden oplossing om verse HBSS-glucose na ontleden 3 hersenen.

Deel 4: celsuspensie

1. Zodra alle dissecties klaar zijn, verwijdert u de HBSS-glucose uit de tube en vervang deze door de papaïne oplossing gemaakt in stap 2.4. Hoewel de kit beveelt het snijden van het weefsel in kleine stukjes, vinden we dat het niet nodig is te snijden of het cerebella gehakt op deze leeftijd. Leg het weefsel + papaïne-oplossing (in een 15 ml conische buis) in een 37 ° C waterbad of 5% CO ₂ 37 ° C incubator gedurende 15 tot 20 minuten. Voor 4 tot 8 cerebella, 15 minuten bij 37 ° C is voldoende, voor een groter aantal cerebella 20 tot 30 minuten is beter. Schud voorzichtig de buis om de 3 tot 4 minuten.
2. Vermaal het mengsel met een steriele P1000 aërosol pipetpunt dat is bedekt met FBS. Doe dit voorzichtig stap om luchtbellen te voorkomen. Brand gepolijst glas pipetten kunnen gebruikt worden, maar wij vinden dat de serum gecoat steriel P1000 spuitbus tips werken net zo goed. Om de vacht van de pipetpunt met FBS, pipet FBS op en neer twee keer vlak voor gebruik. Ongeveer 10 op en neer bewegingen met de pipet zijn voldoende om het weefsel dissociëren. De oplossing zal troebel wordt. Geven om de schorsing te zitten voor 30-60 seconden dat elke grote stukken van ongedissocieerde weefsel zal naar de bodem van de buis.
3. Verwijder de geschorste cellen (Pas op dat u de ongedissocieerde weefsel stukken te verwijderen op de bottom) in een frisse 15 ml conische buis met een serum gecoate pipetpunt. Centrifugeer op ongeveer 200xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Bereid de resuspensie medium. Om dit te doen, mix 2,7 ml EBSS met 300 ul van gereconstitueerd albumine-ovomucoid inhibitor-oplossing in een steriele buis. Voeg 150 ul van DNase-oplossing uit stap 2.4.
4. Na centrifugeren, gooi de supernatant en onmiddellijk de cel pellet opnieuw in suspensie in de verdunde DNase / albumine-remmer bereide oplossing in stap 4.3 met een serum gecoate P1000 spuitbus pipetpunt.
5. Bereid een discontinue dichtheidsgradiënt als volgt. Voeg 5 ml albumine-ovomucoid remmer oplossing om een ​​15 ml conische buis. Voorzichtig laag de celsuspensie op de top. Centrifugeer op ongeveer 70xg gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur. Gescheiden cellen pellet op de bodem van de buis, membraan fragmenten blijven op de interface.
6. Wilt u culturen die verrijkt zijn met granule cellen te verkrijgen, de bypass Percoll verloop scheiding stap (die opbrengst zuiverder culturen van cerebellaire granule cellen), en ga verder met deel 6. Als u verder de granule cellen van de glia en grote interneuronen isoleren door Percoll gradiënt scheiding, ga dan naar deel 5. Gebruik van de Percoll verloop stap zal de opbrengst van cellen. In onze handen, de vermindering van de opbrengst is ongeveer 20-35%. Echter, er is een toename van de verrijking van granule neuronen en stamcellen uit ongeveer 90% naar 95-99%.

Deel 5: Percoll Gradient Scheiding

1. Verwijder het supernatant en onmiddellijk de pellet opnieuw in suspensie in 2 ml HBSS-glucose met 50 ul van DNase uit stap 2.4. Filter de celsuspensie hoewel een nylon mesh (poriegrootte 70 micrometer), door de zwaartekracht. Deze stap verwijdert grote niet-neuronale cellen en zorgt voor een betere enkele celsuspensie.
2. Bereid twee brand-gepolijst glas pasteurpipetten. Om dit te doen, voorzichtig vlam het uiteinde van een glazen pipet tot aan de rand is gladder en de pipet boring is 40-50% van de oorspronkelijke grootte. Zorg ervoor dat om de opening te klein.
3. Bereid Percoll verloop. Breng 10 ml van 35% Percoll oplossing in een 50 ml steriel conische buis. 60% Percoll (10 ml) wordt geladen in een 10 ml steriele spuit met een steriele naald bevestigd spinale. Voorzichtig laag van de 60% Percoll oplossing onder de 35%-oplossing, door het toevoegen van de 60%-oplossing op de bodem van de buis met de spinale naald. Zorg ervoor dat een scherpe interface tussen de twee lagen te houden. Voeg de cellen naar de top van de gradiënt met behulp van een brand-gepolijste pipet voorzichtig toe te voegen aan de zijkant van de buis zonder de interface.
4. Plaats voorzichtig de buis in de centrifuge en centrifugeer bij 1800xg. Opvoeren van de snelheid een stap om de 20 seconden (in stappen van de snelheid zijn als volgt: ongeveer 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg), zodat het duurt ongeveer 2 minuten te bereiken van de gewenste snelheid. Start de timer tot 10 min wanneer 1800xg is bereikt. Wanneer u klaar bent, verlagen de snelheid geleidelijk een stap om de 20 seconden.
5. Verwijder de bovenste interface van de gradiënt (met grote glia, Purkinje cellen en interneuronen) en gooi.
6. Verwijder voorzichtig de cellen op het grensvlak tussen de 35% en 60% Percoll met een brand-gepolijste pipet en over te dragen aan een 50 ml conische buis. Resuspendeer in drie volumes van HBSS-glucose en meng door een paar keer. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1100xg.
7. Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 4 ml 10% FBS medium met 50 ul van DNase. Resuspendeer de pellet zachtjes met een brand-gepolijst pipet aan op een enkele cel suspensie te vormen. Ga verder met 6,2 stap.

Deel 6: Pre-plating en Plating

1. Verwijder het supernatant en onmiddellijk de pellet opnieuw in suspensie in 4 ml van 10% FBS medium met 50 ul van DNase uit stap 2.4. Filter de celsuspensie hoewel een nylon mesh (poriegrootte 70 micrometer), door de zwaartekracht. Deze stap verwijdert grote niet-neuronale cellen en zorgt voor een betere enkele celsuspensie.
2. Het bord van de verzamelde cellen op een poly-D-lysine gecoate pre-plating schotel gedurende 20 minuten in een 5% CO ₂ 37 ° C incubator. Herhalen met een verse schotel. De astroglia en zwaarder cellen zullen tot rust komen en zich te houden aan de gerechten en laat de kleine korrel neuronen en neuron progenitorcellen drijven. Na de incubatie, zijn losjes aangehouden granule neuronen en neuron progenitor cellen zitten snel los en los met zachte tikken van de plaat.
3. Verzamel de korrel neuronen en neuron progenitor cellen in een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 200xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer de pellet in 1 ml serum-vrij medium en tellen een hoeveelheid van 10 ul met behulp van een hemocytometer.
4. Voeg serum-vrij medium om de gewenste cel dichtheid te bereiken. Rough richtlijnen om aantallen cellen te plaat voor medium density: voor 6-well platen, 3,5 tot 4 miljoen cellen; voor 4-putjes, 650.000 cellen. Voor 6-putjes, ik plaat 1,5 ml / putje en voor 4 goed plates, ik plaat 0,5 ml / putje. De cellen worden bijgehouden in een 5% CO ₂ 37 ° C incubator. Geheel veranderen van de medium 24 uur later met de latere wijzigingen om de twee tot drie dagen.

Discussion

Dit protocol is gebaseerd op de wijzigingen van de procedures die zijn beschreven in het verleden ^3,7,11. Er zijn een aantal belangrijke punten om op te merken, zoals hieronder besproken.

De korrel neuronen en progenitor cellen zich binnen 2 uur in de platen. Gezonde cellen hebben een ronde morfologie onder de fase-contrast microscoop ^4. Binnen 24 uur na plating, zullen gezonde cellen verspreid over heel de dekglaasjes of het plastic goed en vormt processen. Op het moment van het eerste medium te veranderen, na 24 uur, zal er een paar dode drijvende cellen. Dit is normaal, als een enkele cellen zullen sterven of worden ongezond tijdens de dissociatie proces. Echter, als na 48 uur de cellen samen samengeklonterd met varicosities op hun processen, ofwel de cellen zijn ongezonde of de poly-D-lysine substraat is giftig. Zoals bij de meeste ondergronden, de werkzaamheid van poly-D-lysine is veel afhankelijk en elke nieuwe partij moet worden getest. Beelden van gezonde culturen kan worden gevonden in de referenties ^4,11, en ^​​20. Gezonde cellen kunnen worden gehandhaafd in de cultuur voor maximaal twee weken ^8.

Korrel neuron voorlopercellen beginnen te differentiëren op plating ^8,12,13,14. Zodra de optimale plating dichtheid wordt vastgesteld voor je studie, moet deze worden gehandhaafd, omdat de proliferatie wordt bevorderd door factoren zoals Notch signalering ^15, en cellen vermenigvuldigen meer bij hogere dichtheden. De proliferatie van korrel neuron voorouders aanzienlijk kan worden verlengd door het toevoegen van sonic hedgehog (Shh) aan het medium ^12,13,14. Laminine kan ook worden toegevoegd als een substraat in aanvulling op poly-D-lysine aan neurietuitgroei ^16,17 te bevorderen. Deze kenmerken van de korrel celcultuur biedt een systeem voor het bestuderen van zowel de biologie van de korrel neuronen of de regulering van de differentiatie van stamcellen tot neuronen ^6,18,19.

Geïsoleerd cerebellaire cellen van postnatale muizen zijn in eerste instantie bestaan ​​uit een mengsel van granule neuronen en korrel neuron voorouders in verschillende stadia van de celcyclus ^8. Er zijn ook astroglia en interneuronen in de isolatie / cultuur en de verdere zuivering van granule neuronen en granulaat voorouders (95% -99%) wordt bereikt door de Percoll verloop scheiding ^4. Verrijkt granule cellen verkregen zonder het gebruik van de Percoll gradiënt scheidingsstap zijn gebruikt om de regulatie van proliferatie en differentiatie van granulaat neuron voorouders, ^18,19,20 studie. Ter ondersteuning van deze, we vinden dat cellen in de populatie geïsoleerd door het omzeilen van de Percoll verloop scheiding stap robuust te reageren op Shh door te blijven in de cel cyclus voor meerdere dagen, en dat zonder Shh Daarnaast is er zeer weinig proliferatie in de culturen, zoals aangegeven door kleuring met de celproliferatie maker, Ki67. Echter, als de culturen om te worden gebruikt na een aantal dagen in vitro, is het aanbevolen dat de Percoll verloop stap worden opgenomen om verontreiniging van het granulaat neuronen verminderen door prolifererende niet-neuronale cellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell strainer with 70μm mesh pore	BD Biosciences	352350
Spinal Needle	BD Biosciences	405182	20G x 3-1/2 inches
Poly-D-Lysine mol wt>300,000	Sigma-Aldrich	P1024	Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested.
Percoll	Sigma-Aldrich	P-1644
Penicillin-Streptomycin (100X)	Sigma-Aldrich	P4333
HBSS	Invitrogen	14175-103	Must be calcium and magnesium free.
Neurobasal A-Medium	Invitrogen	10888-022
Glutamax I supplement	Invitrogen	35050-061
B-27 Serum Free Supplement (50x)	Invitrogen	17504-044
12-mm circle coverslips	Carolina Biological	63-3029	These are made in Germany by Deckgluder.
25-mm circle coverslips	Carolina Biological	63-3037	These are made in Germany by Deckgluder.
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical	LK 003150	Kit is good for five isolations.
Permaset scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS6782
Dumont #5 (Dumostar)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS4978
4-well culture dish	Nalge Nunc international	176740
6-well culture dish	Nalge Nunc international	140685