Isolement et culture de la Post-Natal cellules granulaires du cervelet de la souris progénitrices Neuron et les neurones

Summary

Nous présentons ici une méthode pour isoler et cultiver des cellules granulaires du cervelet et les neurones neurones progénitrices granulaires du cervelet de souris postnatale.

Abstract

Le cortex cérébelleux est une structure bien décrite qui fournit des occasions uniques pour l'étude des propriétés des neurones et ^1,2 de développement. Parmi les types de neurones du cervelet (cellules granulaires, les cellules de Purkinje et les interneurones inhibiteurs), les neurones granulaires sont de loin les plus nombreux et sont le type le plus abondant de neurones dans le cerveau des mammifères. Chez les rongeurs, les neurones granulaires du cervelet sont générés au cours des deux premières semaines post-natale à partir de cellules progénitrices dans la couche la plus superficielle du cortex cérébelleux, la couche granulaire externe (EGL). Le protocole présenté ici décrit les techniques d'enrichir et de neurones granulaires de la culture et de leurs cellules progénitrices du cervelet de souris post-natale. Nous allons décrire les procédures pour obtenir des cultures de pureté croissante ^{3,4, ce} qui peut être utilisé pour étudier la différenciation de la prolifération des cellules progénitrices dans les neurones granulaires ^5,6. Une fois les cellules progénitrices se différencier, les cultures fournissent également une population homogène de neurones granulaires pour la manipulation expérimentale et la caractérisation des phénomènes tels que la synaptogenèse, la fonction des récepteurs du glutamate ^7, interaction avec d'autres cellules purifiées cérébelleuse ^8,9 ou ⁷ la mort cellulaire.

Protocol

Partie 1: Mise en place (1-2 jours avant la dissection) (non représenté sur la vidéo)

1. PREPARATION DE SOLUTIONS DE CULTURE ET MÉDIAS:
   • 4X CMF-PBS-EDTA (calcium et magnésium libre-tampon phosphate salin-EDTA pour des dilutions de Percoll): litre, ajouter 32 g de NaCl, 1,2 g de KCl, 8 g de glucose, 2 g de NaH ₂ PO _4, 1 g de KH ₂ PO _4, 8 ml de 2% de NaHCO ₃ actions, 10 ml d'EDTA 1 M (pH 8,0) à l'eau distillée / désionisée. Réglez le volume à 1 litre et le pH à 7,4. Stériliser par filtration.
   • HBSS-glucose: glycémie Ajouter (6 grammes / litre) pour le calcium et le magnésium Solution gratuite de Hank équilibre du sel (HBSS) et le filtre stérile. 500 ml peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu'à un mois.
   • MILIEUX DE CULTURE: un milieu sans sérum (SFM) et 10% moyennes FBS. Pour 48 ml d'Neurobasal A-Medium ajouter 500 ul 100X glutamax I, 500 ul 100X pénicilline-streptomycine (100 unités finales pénicilline et la streptomycine 100 ug), 6,25 M de KCl 2 ul (finale 250 pM). Split en deux aliquotes de 9 ml et 40 ml. Pour préparer 10% de FBS moyenne, ajouter 1ml de chaleur FBS inactivé à l'aliquote de 9 ml. Pour préparer l'AFD, ajouter 800 ul du supplément sans sérum B-27 à l'aliquote de 40 ml. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C pour un maximum de 2 semaines. Pour de meilleurs résultats font les médias fraîche pour chaque expérience.
2. La préparation des dilutions PERCOLL:
   • Percoll est fourni sous forme liquide et il doit être acidifié avant utilisation. Pour préparer le bouillon, ajouter HCl 1N peu à peu à la solution de Percoll sur une période de 1-2 heures jusqu'à un pH de 7,4 est atteint. Ajout de l'HCl trop rapidement provoquera l'Percoll à agréger. Environ 6,5 ml de HCl 1N sont nécessaires pour chaque litre de Percoll. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C.
   • A 35% et 60% (vol: vol) de dilution Percoll sera utilisé dans l'étape gradient de Percoll. Préparer 100 ml de Percoll dilutions contenant 35 ou 60 ml de Percoll stock, 25 ml de 4X CMF-PBS-EDTA et distillée / désionisée H2O au volume final. Ajouter quelques gouttes de bleu de toluidine à la solution de 60%; elle aider à visualiser l'interface et les cellules. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C.
   • 4X CMF-PBS-EDTA ne doivent pas être âgés de plus de trois mois, comme en mémoire tampon inadéquate peut entraîner la mort cellulaire accrue lors de la procédure.
3. Lamelles PRÉPARATION: lamelles de verre (la meilleure de Carolina Biological Supply Company) sont lavées avec HCl à 10% durant la nuit à température ambiante avec une légère agitation, soigneusement rincées à l'eau distillée / deonized eau et conservés dans l'éthanol à 70%. Avant utilisation, des lamelles simples sont stérilisées à la flamme par un bref en les tenant avec des pinces sur une flamme nue (bec Bunsen) jusqu'à l'évaporation de l'éthanol. Lamelles de verre de 12 mm peuvent être placés dans des plaques de culture à 4 puits et de 25 mm lamelles en plaques de culture 6 puits.
4. Des récipients de culture REVÊTEMENT avec le substrat: Pour la coloration immunofluorescence ou des lamelles de verre de drogue traitements sont plus appropriés, car ils peuvent être facilement montés sur lames de verre pour une visualisation sous un microscope. Lorsqu'un grand nombre de cellules nécessaires pour la collecte des échantillons de protéines ou d'ARN, les cellules peuvent être cultivées sur la culture en plastique la nuit offre des plats avant dissection, des lamelles de verre ou de vaisselle en plastique pour la culture doivent être recouvertes de poly-D-lysine (500 pg / ml; 800 ul / puits pour plaques de 6 puits ou 350 l / puits pour les 4-puits). 5 mg / ml de solution concentrée de poly-D-lysine est stocké à -20 ° C, puis dilué dans distillée stérile / deonized l'eau et stérile droite filtrée avant utilisation. Des récipients de culture sont incubées à 37 ° C pendant une nuit (ou au moins pendant 2 heures avant le placage) et lavées deux fois avec le droit de l'eau distillée stérile / deonized avant l'ensemencement.
5. La préparation des plats PREPLATING: Ces plats seront utilisés pour le pré-placage des cellules isolées du cervelet avant la culture pour éliminer les contaminants gliales, qui adhèrent plus facilement à une faible concentration de substrat. Manteau deux 60 mm en plastique des boîtes de culture à 4 ml par boîte de poly-D-lysine (100 pg / ml; Notez que ceci est 1 / 5 de la concentration utilisée pour la culture). Incuber à 37 ° C pendant une nuit (ou au moins pendant 2 heures avant dissection). Juste avant la dissection, retirer la solution de poly-D-lysine, laver la vaisselle deux fois avec de l'eau stérile et laisser sécher sous la hotte.
6. Stériliser les outils de dissection à l'autoclave ou le jour de la dissection, immerger les outils dans l'éthanol 70% pendant 20 minutes. Outils nécessaires: ciseaux Permaset, ciseaux microdissecting, quatre Dumont # 5 pinces à disséquer.

Partie 2: Préparation pour la dissection (jour de la dissection) - (Démonstration en vidéo)

Toutes les procédures suivantes sont effectuées dans une hotte de culture de tissus, sauf indication contraire.

1. Essuyez la zone de dissection à l'éthanol 70%. Chaud les médias à 37 ° C dans un bain-marie ou dans un 5% de CO ₂ 37 ° C incubateur.
2. Lors du démarrage d'un nouveau système de dissociation papaïne Kit (Worthington), préparer la solution d'albumine-ovomucoïde inhibiteur. Ajouter 32 mlde EBSS (solution saline équilibrée de Earle; fourni dans le kit) pour le mélange inhibiteur de l'albumine ovomucoïde et permettent de dissoudre le contenu tout en préparant les autres composants. Reconstituer pour la première utilisation, puis stocker le reste de la solution à 2-8 ° C et utiliser jusqu'à cinq isolements permis par chaque kit sont terminées.
3. Ajouter 5 ml d'un flacon d'EBSS papaïne du Kit de dissociation (chaque flacon est suffisant pour la dissociation de 4 à 15 jours après la naissance de cervelets 5 souris). Placer le flacon papaïne dans un 5% de CO ₂ 37 ° C incubateur ou bain à 37 ° C pour l'eau 5 à 10 minutes jusqu'à ce que la papaïne est complètement dissous et la solution semble claire. Maintenir la solution à température ambiante pendant la dissection.
4. Ajouter 500 pi de EBSS d'un flacon de DNase dans le Kit de dissociation. Mélanger délicatement en tapotant le flacon depuis DNase est sensible à la dénaturation de cisaillement. Ajouter 250 ul de cette solution dans le flacon contenant la papaïne (concentration finale est de 20 unités / ml et la papaïne 0,005% DNase). Enregistrer le flacon reste DNase pour une utilisation dans l'étape 5.1 ou 6.1.

Partie 3: Dissection et de suppression Méninges

1. L'âge optimal pour la culture cellulaire à partir de granules souris C57BL/6J est jour postnatal 4-6, lorsque le nombre de progéniteurs des cellules granulaires dans le EGL peaks1, 10. Disséquer les chiots un par un et que vous devenez plus familiers avec la dissection cérébelleuse essayer de réduire le temps de dissection à pas plus de 6 minutes par chiot. La vitesse est de l'essence.
   Si l'étape de gradient de Percoll est contourné, huit souriceaux postnatale jours-5 peut produire suffisamment de cellules pour une plaque de culture de 6 puits (ou six lamelles de 25 mm) ou de six plaques de culture à 4 puits (ou vingt-quatre 12 - lamelles mm). Rendement approximatif est de 4 à 5x106 cellules par des densités chiot et le placage peut varier entre 1 et 5.105 cellules/cm2. Comme les cellules de 15-20% sont perdus pendant la step4 Percoll, plus d'animaux sont nécessaires pour obtenir la même densité cellulaire désirée.
2. Pipeter 15 ml de HBSS-glucose dans un plat de 60 mm de culture de tissus en plastique et 10 ml dans une solution stérile Falcon 15 ml tube en plastique conique. Mis sur la glace.
3. En dehors de la hotte, essuyez la tête du chiot avec de l'éthanol à 70%. Utilisez des ciseaux Permaset à décapiter le chiot. (Décapitation ne sera pas montré dans la vidéo.)
4. Dans la hotte, maintenez la tête avec une pince Dumont de sorte que vous pouvez clairement voir l'arrière du crâne. Accès au cerveau en insérant des ciseaux microdissecting dans le foramen magnum et coupe droite vers les yeux. En utilisant une pince, décoller la peau et soulevez le crâne afin d'exposer le cerveau. En utilisant des pinces Dumont, pincez le cervelet et le mésencéphale environnante et le transférer dans le plat avec du HBSS-glucose. (Il est plus facile de manipuler le cervelet et de supprimer les méninges si le cervelet est encore attaché aux tissus environnants).
5. Sous la loupe binoculaire, retirez délicatement les méninges hors du cervelet et aussi entre les lobes avec un beau Dumont # 5 pince tout en utilisant la pince d'autres pour ancrer le bas le cervelet à la plaque. Vous remarquerez les vaisseaux sanguins à la surface du cervelet. Ces vaisseaux sanguins sont un bon moyen d'identifier les méninges. Retirez les méninges jusqu'à ce que le cervelet prend un aspect mat blanc. Séparez le cervelet du reste du mésencéphale. Tournez à sa face ventrale et enlever la choroïde, plexus qui ressemble à un ruban rouge entre le cervelet et le mésencéphale ventral adjacentes. Placez chaque cervelet froide HBSS-glucose dans un tube de 15 ml conique sur la glace dès que disséqués. Les changements de la solution fraîche à dissection pour HBSS glucose après-dissection 3 des cerveaux.

Partie 4: suspension cellulaire

1. Une fois toutes les dissections sont terminées, retirez le HBSS-glucose dans le tube et le remplacer par la solution papaïne faite à l'étape 2.4. Bien que le kit recommande couper le tissu en petits morceaux, nous constatons qu'il n'est pas nécessaire de couper ou de hacher les cervelets à cet âge. Placez la solution la papaïne tissus + (dans un tube conique de 15 ml) dans un bain d'eau à 37 ° C ou 5% de CO ₂ 37 ° C incubateur pour 15 à 20 minutes. Pour 4 à 8 cervelets, à 15 minutes à 37 ° C est suffisante, car un grand nombre de cervelets 20 à 30 minutes est la meilleure. Agiter doucement le tube toutes les 3 à 4 minutes.
2. Triturer le mélange avec une solution stérile P1000 pointe de la pipette d'aérosol qui a été enduit avec du FBS. Faites cette étape en douceur pour éviter toute formation de bulles d'air. Pipettes en verre poli au feu peuvent être utilisées, mais nous constatons que le sérum stérile recouvert P1000 conseils aérosols fonctionnent tout aussi bien. Pour manteau de la pipette avec du FBS, FBS pipette haut et en bas deux fois juste avant utilisation. Environ 10 mouvements de haut en bas avec la pipette sont suffisantes pour dissocier les tissus. La solution devient trouble. Autoriser la suspension de s'asseoir pendant 30-60 secondes pour que les gros morceaux de tissu non dissocié se déposent au fond du tube.
3. Retirer les cellules en suspension (attention à ne pas enlever les morceaux de tissu non dissocié à la bottom) dans un nouveau tube conique 15 ml avec un embout de pipette de sérum revêtement. Centrifuger à environ 200xg pendant 5 minutes à température ambiante. Préparer la remise en suspension à moyen terme. Pour ce faire, mélanger 2,7 ml EBSS avec 300 ul de solution d'inhibiteur reconstitué albumine ovomucoïde dans un tube stérile. Ajouter 150 pi de solution de DNase partir de l'étape 2.4.
4. Après centrifugation, éliminer le surnageant et immédiatement resuspendre le culot cellulaire dans la dilution de DNase / solution d'inhibiteur d'albumine préparée dans l'étape 4.3 avec un sérum revêtement P1000 aérosols pointe de la pipette.
5. Préparer un gradient de densité discontinu comme suit. Ajouter 5 ml de solution d'inhibiteur ovomucoïde albumine dans un tube de 15 ml conique. Soigneusement la couche de cellules en suspension sur le dessus. Centrifuger à environ 70xg pendant 6 minutes à température ambiante. Les cellules dissociées granulés au fond du tube, des fragments de membranes restent à l'interface.
6. Si vous souhaitez obtenir des cultures qui sont enrichies en cellules granulaires, contourner l'étape de séparation de gradient de Percoll (qui rendements des cultures pures de cellules granulaires du cervelet), et passez à la partie 6. Si vous souhaitez isoler davantage les cellules granulaires du gliales et des interneurones grande partie par la séparation gradient de Percoll, passez à la partie 5. Utilisation de l'étape gradient de Percoll permettra de réduire le rendement des cellules. Dans nos mains, la réduction du rendement est d'environ 20-35%. Cependant, il ya une augmentation dans l'enrichissement des neurones granulaires et les cellules progénitrices d'environ 90% à 95-99%.

Partie 5: séparation par gradient de Percoll

1. Jeter le surnageant et immédiatement Reprendre le culot dans 2 ml de HBSS-glucose avec 50 ul de DNase partir de l'étape 2.4. Filtrer la suspension cellulaire si un filet de nylon (taille des pores 70 um) par gravité. Cette étape va supprimer de grandes cellules non-neuronales et prévoit une suspension cellulaire unique de mieux.
2. Préparer deux polie au feu en verre Pipettes Pasteur. Pour ce faire, doucement le bout de la flamme d'une pipette de verre jusqu'à la pointe est lissée et l'alésage pipette est de 40-50% de la taille originale. Prenez soin de ne pas faire l'ouverture trop petite.
3. Préparer gradient de Percoll. Placer 10 ml de solution de Percoll à 35% dans un tube de 50 ml conique stérile. 60% (10 ml) de Percoll est chargé dans une seringue de 10 ml stérile avec une aiguille stérile épinière attachée. Couche doucement la solution de Percoll à 60% en dessous de la solution 35%, en ajoutant la solution de 60% dans le bas du tube avec l'aiguille spinale. Prenez soin de garder une interface nette entre les deux couches. Ajouter les cellules vers le haut de la pente à l'aide d'une pipette polie au feu, les délicatement en ajoutant le long du côté du tube sans déranger l'interface.
4. Placez délicatement le tube dans la centrifugeuse et centrifuger à 1800xg. Montée en puissance de la vitesse d'un pas toutes les 20 secondes (par incréments de vitesse sont les suivantes: environ 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg) afin qu'il dure environ 2 minutes pour atteindre la vitesse désirée. Démarrer le chronomètre à 10 min lorsque 1800xg est atteint. Lorsque vous avez terminé, diminuer graduellement la vitesse d'un pas toutes les 20 secondes.
5. Enlever l'interface supérieure de la pente (contenant glie grande, les cellules de Purkinje, et des interneurones) et le jeter.
6. Retirez délicatement les cellules à l'interface entre les 35% et de Percoll à 60% avec une pipette polie au feu et transférer dans un tube conique de 50 ml. Remettre en suspension dans 3 volumes de HBSS-glucose et mélanger en retournant plusieurs fois. Centrifuger pendant 5 minutes à 1100xg.
7. Enlever le surnageant et ajouter 4 ml de milieu de FBS à 10% avec 50 ul de DNase. Reprendre le culot doucement à l'aide d'une pipette polie au feu pour former une suspension cellulaire unique. Passez à l'étape 6.2.

Partie 6: Pré-placage et placage

1. Jeter le surnageant et immédiatement Reprendre le culot dans 4 ml de milieu de FBS à 10% avec 50 ul de DNase partir de l'étape 2.4. Filtrer la suspension cellulaire si un filet de nylon (taille des pores 70 um) par gravité. Cette étape va supprimer de grandes cellules non-neuronales et prévoit une suspension cellulaire unique de mieux.
2. Plaque les cellules recueillies sur une poly-D-lysine revêtement pré-placage plat pendant 20 minutes dans un 5% de CO ₂ 37 ° C incubateur. Répétez l'opération avec un plat frais. Les cellules astrocytes et plus lourdes vont se calmer et de respecter les plats et de laisser les neurones granulaires petites et les cellules progénitrices de neurones flottant. Après l'incubation, les neurones granulaires vaguement adhéré et les cellules progénitrices de neurones sont facilement délogés et desserré avec les tapotant doucement de la plaque.
3. Recueillir les neurones granulaires et des cellules progénitrices de neurones dans un tube de 15 ml conique et centrifuger à 200xg pendant 5 minutes. Reprendre le culot dans 1 ml de milieu sans sérum et compter une aliquote de 10 pi en utilisant un hématimètre.
4. Ajouter un milieu sans sérum pour atteindre la densité cellulaire désirée. Directives Rough nombre de cellules à la plaque à densité moyenne: pour plaques de 6 puits, 3,5 à 4 millions de cellules; pour les plaques à 4 puits, 650 000 cellules. Pour plaques de 6 puits culture, je la plaque 1,5 ml / puits et des puits 4-plaTES, je plaque de 0,5 ml / puits. Les cellules sont maintenues dans un 5% de CO ₂ 37 ° C incubateur. Changer le support totalement 24 heures plus tard avec des modifications ultérieures tous les deux à trois jours.

Discussion

Ce protocole est basé sur les modifications de procédures qui ont été décrites dans le ^3,7,11 passé. Il ya plusieurs points importants à noter que discuté ci-dessous.

Les neurones granulaires et les cellules progénitrices se conformer dans les 2 heures de placage. Les cellules saines ont une morphologie ronde sous le microscope de ⁴ à contraste de phase. Dans les 24 heures après l'étalement, les cellules saines seront réparties uniformément autour du lamelles en plastique ou le bien et feront processus. Au moment du changement de support d'abord, après 24 heures, il y aura un peu de cellules mortes flottant. C'est normal, car quelques cellules vont mourir ou devenir malsain pendant le processus de dissociation. Toutefois, si après 48 heures, les cellules sont groupées avec les varicosités sur leurs processus, soit les cellules sont insalubres ou le substrat poly-D-lysine est toxique. Comme avec la plupart des substrats, l'efficacité de la poly-D-lysine est beaucoup dépendants et chaque nouveau lot doit être testé. Images des cultures saines peuvent être trouvés dans les références ^{4,11 et 20.} Les cellules saines peuvent être maintenues en culture pendant jusqu'à deux semaines ^8.

Progéniteurs des neurones granules commencent à se différencier sur plaquage ^8,12,13,14. Une fois la densité de placage optimal est établi pour vos études, il doit être maintenu, parce que la prolifération est favorisée par des facteurs tels que signalisation Notch ^15, et les cellules prolifèrent plus à des densités plus élevées. La prolifération des progéniteurs des neurones granulaires peuvent être sensiblement prolongée par l'ajout Sonic Hedgehog (Shh) à ^l'12,13,14 moyenne. La laminine peut également être ajouté comme substrat, en plus de poly-D-lysine pour favoriser la croissance des neurites ^16,17. Ces caractéristiques de la culture de cellules granulaires proposer un système pour étudier soit la biologie des neurones granulaires ou la régulation de la différenciation de cellules précurseurs des neurones ^6,18,19.

Isolé des cellules du cervelet de souris postnatale sont initialement composé d'un mélange de neurones granulaires et des progéniteurs des neurones granulaires à différents stades du cycle de ⁸ cellules. Il ya aussi des astrocytes et des interneurones présent dans l'isolement / culture et purification des neurones granulaires et des progéniteurs de granulés (95% -99%) est atteint par la séparation gradient de Percoll ^4. Enrichi cellules granulaires obtenus sans l'utilisation de l'étape de séparation de gradient Percoll ont été utilisées pour étudier la régulation de la prolifération et la différenciation des progéniteurs des neurones granulaires, ^18,19,20. Pour corroborer cela, nous constatons que les cellules isolées dans la population en contournant l'étape de séparation de gradient Percoll réagir énergiquement face à Shh en restant dans le cycle cellulaire pendant plusieurs jours, et que sans plus Shh, il ya très peu de la prolifération dans les cultures comme indiqué par coloration avec le fabricant de la prolifération cellulaire, Ki67. Cependant, si les cultures doivent être utilisés au-delà de quelques jours in vitro, il est recommandé que l'étape de gradient de Percoll être inclus pour diminuer la contamination de l'neurones granulaires par la prolifération des cellules non neuronales.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell strainer with 70μm mesh pore	BD Biosciences	352350
Spinal Needle	BD Biosciences	405182	20G x 3-1/2 inches
Poly-D-Lysine mol wt>300,000	Sigma-Aldrich	P1024	Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested.
Percoll	Sigma-Aldrich	P-1644
Penicillin-Streptomycin (100X)	Sigma-Aldrich	P4333
HBSS	Invitrogen	14175-103	Must be calcium and magnesium free.
Neurobasal A-Medium	Invitrogen	10888-022
Glutamax I supplement	Invitrogen	35050-061
B-27 Serum Free Supplement (50x)	Invitrogen	17504-044
12-mm circle coverslips	Carolina Biological	63-3029	These are made in Germany by Deckgluder.
25-mm circle coverslips	Carolina Biological	63-3037	These are made in Germany by Deckgluder.
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical	LK 003150	Kit is good for five isolations.
Permaset scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS6782
Dumont #5 (Dumostar)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS4978
4-well culture dish	Nalge Nunc international	176740
6-well culture dish	Nalge Nunc international	140685