Post-Natal Mouse Serebellar Granül Nöron Progenitör Hücreler ve Nöronlar İzolasyon ve Kültür

Summary

Burada izole etmek için bir yöntem ve postnatal fare kültür serebellar granül nöron progenitör hücreleri ve serebellar granül nöronlar sunuyoruz.

Abstract

Serebellar kortekste nöronal özellikleri ve gelişimi ^1,2 okuyor için eşsiz fırsatlar sunan bir iyi tanımlanmış bir yapıdır . Serebellar nöronal türleri (granül hücreleri, Purkinje hücreleri ve inhibitör), granül nöronlar tarafından bugüne kadar en çok sayıda ve en bol memeli beyindeki nöronların türüdür. Kemirgenler, serebellar granül nöronlar serebellar korteks, dış granül tabakası (EGL) en dış tabakası progenitör hücrelerden doğum sonrası ilk iki hafta boyunca oluşturulur. Burada sunulan protokol zenginleştirmek için kültür teknikleri ve granül nöronlar ve post-natal fare beyincik progenitör hücrelerin açıklamaktadır. Biz granül nöronlar ^5,6 progenitör hücrelerin prolifere farklılaşma çalışma için kullanılabilir artan saflık ^3,4 kültürleri elde etmek için prosedürler anlatacağız. Bir kez progenitör hücrelerin kültürleri de sinaptogenez, glutamat reseptör fonksiyonu ^7, diğer saflaştırılmış serebellar hücreleri ^8,9 veya hücre ölümünü ⁷ ile etkileşim gibi olayların deneysel manipülasyon ve karakterizasyonu granül nöronların homojen bir nüfus sağlamak, ayrım.

Protocol

Bölüm 1: (video gösterilmemiştir) (diseksiyon 1-2 gün önce) ayarlama

1. Kültür ÇÖZÜMLER VE MEDYA HAZIRLAMA:
   • 4X CMF-PBS-EDTA (kalsiyum ve magnezyum Percoll dilüsyonları için serbest fosfat tamponlu tuzlu-EDTA): litre başına 32 g NaCl, 1,2 g KCl, 8 g glukoz, 2 g NaH ₂ PO _4, 1 g KH ₂ PO eklemek _4, 8 ml% 2 NaHCO ₃ hisse senedi, deiyonize / distile su 10 ml 1M EDTA (pH 8.0). 1 litre ve pH 7.4 'e ses seviyesini ayarlayın. Sterilize Filtresi.
   • HBSS-GLİKOZ: kalsiyum ve magnezyum ücretsiz Hank Dengesi Tuz Çözeltisi (HBSS) ve steril filtre ekle glikoz (6 gram / litre). 500 ml, 4 ° C ile bir ay kadar saklanabilir.
   • Kültür MEDYA: serum orta (SFM) ve% 10 FBS orta. 48 ml Neurobasal A-Orta 500 ul 100X GlutaMAX I, 500 ul 100X Penisilin-Streptomisin (son 100 Birimleri penisilin ve 100 mg streptomisin), 6.25 ul 2 M KCl (250 nihai mcM) ekleyin. Split 2 alikotları 9 ml ve 40 ml. % 10 FBS ortamı hazırlamak için, 9 ml kısım ısı ile inaktive edilmiş FBS 1ml ekleyin. SFM hazırlamak için, 800, 40 ml kısım serum B-27 takviyesi ul ekleyin. Sterilize Filtre ve 2 hafta en fazla 4 ° C'de saklamak. En iyi sonuç için her bir deney için taze medya.
2. Percoll dilüsyonları HAZIRLAMA:
   • Percoll bir sıvı olarak verilir ve kullanmadan önce asitlendirilmiş olmalıdır. PH 7.4 ulaşana kadar stok hazırlamak için 1-2 saatlik bir süre içinde Percoll bir çözüm için çok az 1N HCl biraz ekleyin. Çok hızlı HCl ekleme agrega Percoll neden olacaktır. 1N HCl yaklaşık 6.5ml Percoll her litre için ihtiyaç vardır. Sterilize Filtre ve 4 saklamak ° C
   • % 35 ve% 60 (hacim: hacim) Percoll seyreltme Percoll degrade adım olacaktır. Percoll stokunun 35 ya da 60 ml içeren 100 ml Percoll dilüsyonları hazırlayın, 4X CMF-PBS-EDTA ve damıtılmış 25 ml / H2O son hacim deiyonize. % 60 çözüm mavi toluidin birkaç damla ekleyin; arayüzü ve hücrelerin görselleştirmek yardımcı olacaktır. Sterilize Filtre ve 4 saklamak ° C
   • Yetersiz tamponlama işlem sırasında artan hücre ölümüne sebep olarak 4X CMF-PBS-EDTA, 3 aydan daha eski olmamalıdır.
3. Lamelleri HAZIRLIĞI: Cam lamelleri (Carolina Biyolojik Supply Company en iyi), hafif ajitasyon oda sıcaklığında bir gece boyunca% 10 HCI ile yıkanır deonized / distile su ile iyice durulanması ve% 70 etanol içinde saklanan. Kullanmadan önce, tek lamelleri alev etanol buharlaşır kadar açık bir alev (Bunsen beki) üzerinde kısaca forseps ile tutarak sterilize. 12 mm cam lamelleri, 6-kuyu kültür plakaları 4-kuyu kültür plakaları ve 25 mm lamelleri yerleştirilebilir.
4. SUBSTRAT İLE KAPLAMA Kültür GEMİLER: mikroskop altında kolayca görünüm için cam slaytlar üzerine monte edilebilir beri immünofloresan boyama ya da ilaç tedavileri cam lamelleri için daha uygun. Çok sayıda hücre, protein veya RNA örnekleri toplamak için gerekli zaman, hücreler plastik kültür diseksiyonu önce dishes.The gece kültür olabilir, kültür için cam lamelleri ya da plastik tabaklar poli-D-lisin (500 mg / ml ile kaplı olmalıdır; ul / 6 kuyucuğu için 800 veya 350 ul / iyi 4-iyi plakaları için). 5 mg / ml stok solüsyonu poli-D-lizin -20 ° C, daha sonra, steril deonized / distile su ve kullanmadan önce steril süzülmüş hakkı seyreltilmiş saklanır. Kültür damarları 37 inkübe ° C gecede (veya en az 2 saat önce kaplama için) ve kaplama öncesi, steril deonized / distile su hakkı ile iki kez yıkanır.
5. PREPLATING YEMEKLER HAZIRLIĞI: Bu yemekler düşük substrat konsantrasyonu daha kolay yapışır glial kirleticiler, kaldırmak için izole serebellar hücre kültürü önce ön kaplama için kullanılan olacak. Poli-D-lisin (bu kültür için kullanılan konsantrasyonu 1 / 5 100 mg / ml) çanak başına 4 ml Coat iki adet 60-mm plastik kültür yemekleri. 37 ° ° C'de gece boyunca (ya da en az 2 saat önce diseksiyon için). Sağ diseksiyon önce, poli-D-lizin çözüm kaldırmak için iki kez steril su ile bulaşıkları yıkamak ve kaputun kurumasını bekleyin.
6. Diseksiyon araçları sterilize otoklav veya diseksiyon gün, 20 dakika boyunca% 70 etanol araçları bırakın. Gerekli araçlar: Permaset makas, microdissecting makas, dört Dumont # 5 diseksiyon forseps.

Bölüm 2: Diseksiyon için hazırlık (diseksiyon gün) - (video kanıtlanmış)

Belirtilmediği sürece, aşağıdaki tüm prosedürler, doku kültürü kaputu yapılmaktadır.

1. % 70 etanol ile diseksiyon alanının aşağı silin. 37 ° C su banyosu ya da% 5 CO ₂ 37 ° C inkübatör medya ısıtın.
2. Yeni bir Papain Ayrılma Sistemi Seti (Worthington) başlatırken, albümin ovomucoid inhibitörü çözüm hazırlayın. 32 mlEBSS (Earle Dengeli Tuz Çözeltisi; kiti), albümin ovomucoid inhibitörü karışımı ve diğer bileşenler hazırlarken çözünmesi için izin. Ilk kullanım için sulandırın, sonra 2-8 geriye kalan çözüm saklamak ° C ve her kiti tarafından izin verilen beş izolasyonların tamamlanana kadar kullanabilirsiniz.
3. Ayrılma Kit (Her flakon postnatal günde 5 fareler cerebella 4-15 disosiasyon için yeterli) bir papain flakon EBSS 5 ml ekleyin. Papain flakon yerleştirin% 5 CO ₂ 37 ° C inkübatör veya 37 ° C papain tamamen çözülmüş ve çözüm net görünür kadar 5 ila 10 dakika boyunca su banyosu. Diseksiyon sırasında, oda sıcaklığında çözüm koruyun.
4. Ayrılma Kiti bir DNaz flakon EBSS 500 ul ekleyin. DNaz kesme denatürasyon duyarlı olduğundan flakon dokunarak yavaşça karıştırın. Papain (son konsantrasyon 20 adet / ml papain ve% 0.005 DNaz) içeren Flakon 250 ul bu çözüm ekleyin. 5.1 veya 6.1 adımda kullanmak için kalan DNaz flakon kaydedin.

Bölüm 3: Diseksiyon ve zarları Kaldırma

1. C57BL/6J fareler granül hücre kültürü için en uygun yaş, postnatal günde 4-6, EGL peaks1, 10, granül hücre atalarıdır sayısı. Yavrular bir seferde birini inceleyin ve serebellar diseksiyon daha aşina hale yavru başına en fazla 6 dakika diseksiyonu süresini azaltmak için çalışacağız. Hız özü.
   Percoll degrade adım atlanır ise, sekiz doğum sonrası gün-5 fare yavrular, 6-iyi bir kültür plakasına (ya da altı adet 25 mm lamelleri) veya altı 4 kuyu kültür levhalar (ya da yirmi dört 12 için yeterli hücre verim alınabilir aa lamelleri). Yaklaşık verimi yavru ve kaplama yoğunlukları başına 4 5x106 hücre 1 arasında ve 5X105 cells/cm2 uzanabilir. % 15-20 hücreleri Percoll step4 sırasında kaybolan olduğundan, daha çok hayvanların aynı istenen hücre yoğunluğu elde etmek için ihtiyaç vardır.
2. Pipet 15 ml steril bir Falcon 15 ml konik plastik tüp içine 60 mm plastik doku kültürü çanak ve 10 ml içine HBSS glikoz. Buz koyun.
3. Kaput dışında,% 70 etanol ile yavru başkanı silin. Yavru başını kesmek için Permaset makas kullanın. (Video Decapitation gösterildiği gibi değildir.)
4. Açıkça kafatasının arkasına bakın, böylece kaput, Dumont forseps ile kafa tutun. Foramen magnum microdissecting makas ekleme ve gözleri doğru düz kesim beyin erişin. Uzakta cilt soyma, forseps kullanma ve kafatası beyin açığa çıkarmak için yukarı kaldırın. Dumont forseps kullanarak, beyincik ve çevresindeki orta beyin çimdik ve çanak HBSS-glukoz ile transfer. (Serebellum serebellum hala çevreleyen doku bağlıysa işlemek ve meninksler kaldırmak için daha kolay olur).
5. Diseksiyon mikroskobu altında, beyinciğin kapalı meninksler kabuğu hafifçe ve aynı zamanda plaka beyincik aşağı demirlemek diğer forseps kullanarak güzel bir Dumont # 5 forseps ile loblar arasında. Beyincik yüzeyinde kan damarlarının göreceksiniz. Bu kan damarları meninksler tanımlamak için iyi bir yoldur. Meninksler beyincik keçeleşmiş beyaz bir görünüm alır kadar çıkarın. Geri kalanı orta beyin, beyincik ayırın. Ventral tarafa çevirin ve ventral beyincik ve bitişik orta beyin arasındaki kırmızımsı bir şerit gibi görünüyor koroid pleksus kaldırmak. Kısa sürede disseke olarak buz üzerinde 15 ml konik tüp HBSS-glukoz soğuk her beyincik yerleştirin. 3 beyinlerini parçalayıp sonra taze HBSS-glukoz diseksiyon çözüm değiştirin.

Bölüm 4: Hücre süspansiyon

1. Bir kez tüm diseksiyonları bittiğinde, tüpten HBSS-glukoz kaldırmak ve adım 2.4 'te yapılan papain çözümü ile değiştirin. Küçük parçalar halinde doku kesme kiti tavsiye rağmen, biz bu yaşta cerebella kesmek veya kıyma için gerekli olmadığını bulabilirsiniz. Doku + papain solüsyonu (15 ml konik tüp) yerleştirin 37 ° C su banyosu veya% 5 CO ₂ 37, 15 ila 20 dakika ° C inkübatör . 4-8 cerebella, 37 az 15 dakika ° C yeterlidir; cerebella daha büyük bir sayı için 20 ila 30 dakika daha iyidir. Tüp yavaşça her 3 ila 4 dakika ajitasyon.
2. FBS ile kaplanmış, steril bir P1000 aerosol pipet ucu ile karışım Karışım. Herhangi bir hava kabarcığı oluşumunu engellemek için bu adımı yavaşça yapın. Yangın parlatılmış cam pipetler kullanılır, ama biz serum kaplı steril P1000 aerosol ipuçları gibi iyi çalışır. FBS ile pipet kat için pipet FBS yukarı ve aşağı sadece kullanmadan önce iki kez. Pipet kadar yaklaşık 10 ve aşağı hareketler doku ayırmak yeterli. Çözüm bulutlu olacak. Süspansiyon, herhangi bir undissociated doku büyük parça tüpün dibine yerleşmek böylece 30-60 saniye boyunca oturmak için izin verin.
3. Askıya hücreleri (b undissociated doku parçaları dikkatli kaldırmak için Kaldırserum kaplı pipet ile taze 15 ml konik tüp içine ottom). 5 dakika boyunca oda sıcaklığında yaklaşık 200xg santrifüjleyin. Yeniden süspansiyon ortamı hazırlayın. Bunu yapmak için, 2.7 ml EBSS 300 ul steril bir tüp içinde sulandırılmış albümin ovomucoid inhibitörü çözüm ile karıştırın. Adım 2.4 'ten 150 ul DNaz çözüm ekleyin.
4. Santrifüj sonra, süpernatant atmak ve hemen seyreltilmiş DNaz / serum kaplı P1000 aerosol pipet ile 4,3 adım olarak hazırlanan albumin inhibitörü çözüm hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin.
5. Aşağıdaki gibi süreksiz bir yoğunluk gradiyenti hazırlayın. 5 ml, 15 ml konik tüp albümin ovomucoid inhibitörü çözüm ekleyin. Üst tabaka dikkatlice hücre süspansiyonu. 6 dakika oda sıcaklığında yaklaşık 70xg santrifüjleyin. Tüpün dibinde kontrol grubuyla hücreleri pelet, membran parçaları arayüzü kalır.
6. Granül hücreleri zenginleştirilmiş kültürleri elde etmek isterseniz, Percoll degrade ayrılık adım (serebellar granül hücrelerinin saf kültürler verir) bypass ve Bölüm 6'ya geçin. Daha fazla Percoll degrade ayrılması ile glia ve büyük internöronlar granül hücreleri izole etmek isterseniz, Bölüm 5 geçin. Percoll degrade adım hücre verimi azaltacaktır. Bizim ellerde, veriminde azalma yaklaşık% 20-35. Ancak, yaklaşık% 90 95-99% granül nöronlar ve progenitör hücrelerin zenginleştirilmesi bir artış vardır.

Bölüm 5: Percoll Gradient Ayırma

1. Süpernatantı atın ve hemen adım 2.4 'ten 50 ul DNaz HBSS-glukoz 2 ml pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Yerçekimi ile bir naylon örgü (gözenek büyüklüğü 70 mikron) rağmen hücre süspansiyonu Filtresi. Bu adım, büyük olmayan nöronal hücrelerin kaldırmak ve daha iyi bir tek hücre süspansiyonu sağlar.
2. Iki adet yangın parlatılmış cam Pasteur pipetler hazırlayın. Bunu yapmak için, hafifçe alev kenarına düzeltilir ve pipet deliği kadar bir cam pipet ucu orijinal boyutunun% 40-50. Açılış çok küçük yapmamaya özen gösterin.
3. Percoll degrade hazırlayın. Yeri 10 ml, 50 ml steril konik tüp% 35 Percoll çözüm. % 60 Percoll (10 ml) bağlı steril bir spinal iğne ile 10 ml steril bir şırınga içine yüklenir. % 35 çözüm altında spinal iğne ile tüpün alt kısmında% 60 çözüm ekleyerek yavaşça tabaka% 60 Percoll çözüm. Keskin bir arayüz iki katman arasında tutmaya özen gösterin. Arayüzü bozmadan nazikçe tüpün kenarı boyunca ekleyerek, yangın cilalanmış bir pipet kullanarak degrade üst hücreleri ekleyin.
4. 1800xg santrifüj ve santrifüj tüp dikkatlice yerleştirin. İstediğiniz hızlı ulaşmak için yaklaşık 2 dakika sürer, böylece hız bir adım yukarı her 20 saniyede (yaklaşık 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg hız artışlarla aşağıdaki gibidir) Rampa. 1800xg ulaşıldığında 10 dakika için Sayacı başlat. Bittiğinde, yavaş yavaş bir adım, her 20 saniyede bir hız azalır.
5. Degrade üst arayüzü (büyük glia, Purkinje hücreleri ve internöronlar içeren) çıkarın ve atın.
6. Dikkatlice bir yangın cilalı pipet ve 50 ml konik tüp transfer hücrelerin% 35 ve% 60 Percoll arasında arayüz çıkarın. HBSS-glukoz ve tersini birkaç kez karıştırın 3 cilt halinde süspanse edin. 1100xg az 5 dakika santrifüjleyin.
7. Süpernatantı ve DNaz ul 50 ile% 10 FBS orta 4 ml ekleyin. Nazikçe, tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için yangın cilalanmış bir pipet kullanarak pelletini tekrar. 6.2 adıma geçin.

Bölüm 6: Ön kaplama ve Kaplama

1. Süpernatantı atın ve hemen adım 2.4 'ten 50 ul DNaz ile 4 ml% 10 FBS orta pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Yerçekimi ile bir naylon örgü (gözenek büyüklüğü 70 mikron) rağmen hücre süspansiyonu Filtresi. Bu adım, büyük olmayan nöronal hücrelerin kaldırmak ve daha iyi bir tek hücre süspansiyonu sağlar.
2. Plaka toplanan hücrelerin% 5 CO ₂ 37 ° C inkübatör poli-D-lizin kaplı ön kaplama çanak 20 dakika. Taze bir çanak tekrarlayın. Astroglia ve ağır hücreleri yerleşmek ve yemeklere uygun ve küçük granül nöronlarda ve nöron progenitör hücrelerin kayan bırakın. Inkübasyondan sonra, gevşek yapıştırılır granül nöronlarda ve nöron progenitör hücrelerin kolayca yerinden çıkar ve plaka hafif dokunarak ile gevşetti.
3. 5 dakika için, 200xg 15 ml konik bir tüp ve santrifüj granül nöronlarda ve nöron progenitör hücreleri toplayın. 1 ml serum orta pelletini tekrar ve 10 ul hemasitometre kullanarak bir kısım saymak.
4. Istenilen hücre yoğunluğu ulaşmak için serum serbest orta ekleyin. Orta yoğunluklu levha hücreleri sayıları Kaba kurallar: 6-iyi tabak, 3,5 ila 4 milyon hücre; 4-kuyucuğu, 650.000 hücreleri için. 6-kuyu kültür plakaları, plaka 1.5 ml / iyi ve 4 için iyi plates, plaka 0.5 ml / iyi. Hücreler% 5 CO ₂ 37 ° C inkübatör tutulur. Sonradan yapılan değişiklikleri her iki ila üç gün ile 24 saat sonra tamamen orta değiştirin.

Discussion

Bu protokol, ^geçmiş 3,7,11 tarif edilmiştir prosedürlerin değişiklikler dayanmaktadır . Aşağıda anlatıldığı gibi Unutulmaması gereken birkaç önemli nokta vardır.

Granül nöronlar ve progenitör hücrelerin kaplama 2 saat içinde yapışır. Sağlıklı hücreler, faz kontrast ^mikroskop 4 altında yuvarlak bir morfoloji var . Kaplama sonraki 24 saat içinde, sağlıklı hücreler lamelleri veya plastik kuyu etrafında eşit yayılacak ve süreçler oluşturacaktır. Ilk orta değişim süresi, 24 saat sonra, birkaç ölü yüzen hücreler var olacaktır. Bu, birkaç hücre ayrışma süreci sırasında ölen ya da sağlıksız hale gelecektir olarak normaldir. Ancak, 48 saat sonra hücre süreçlerini varisler ile birlikte kümesinin eğer hücrelerin sağlıksız ya da poli-D-lizin substrat toksik ya. En substratlar gibi, poli-D-lizin etkinliği pek çok bağlıdır ve her yeni sürü test edilmelidir. Görüntüler referanslar ^{4,11 ve 20} sağlıklı kültürlerin bulunabilir. Sağlıklı hücreler, iki ^haftada 8 kültür korunabilir .

Granül nöron atalarıdır kaplama ^8,12,13,14 üzerine ayırt etmek için başlar. Çalışmalar için en uygun kaplama yoğunluğu kurulduktan sonra çoğalması, Notch sinyalizasyon ¹⁵ gibi faktörler tarafından teşvik ve hücreler daha yüksek yoğunluklar daha fazla çoğalacak çünkü muhafaza edilmelidir. Granül nöron atalarıdır yayılması önemli ölçüde ^orta 12,13,14 sonik kirpi (Shh) ekleyerek uzatılabilir . Laminin neurite akıbet ^16,17 teşvik poli-D-lizin ek bir substrat olarak da eklenebilir. Granül hücre kültürü bu özellikleri, granül nöronların biyoloji ya da nöronların ^6,18,19 atalarıdır hücreleri farklılaşma düzenlenmesi ya da çalışmak için bir sistem sunuyoruz.

Postnatal fareler izole serebellar hücreler başlangıçta granül hücre döngüsü ⁸ farklı aşamalarında nöron ve granül nöron atalarıdır karışımından oluşmaktadır. Orada astroglia ve internöronlar Percoll degrade ayırma ⁴ / kültür ve granül nöronlar ve granül atalarıdır (95% -99%) daha fazla arıtma izolasyon elde mevcut. Zenginleştirilmiş Percoll degrade ayırma adım kullanmadan elde edilen granül hücrelerin çoğalması ve granül nöron ^{atalarıdır,} 18,19,20 farklılaşma yönetmelik çalışması için kullanılır olmuştur . Bu corroboration, biz Percoll degrade ayrılık adım Shh Shh ek olmadan birkaç gün boyunca hücre döngüsü kalan sağlam yanıt ve atlayarak izole edilen nüfusun bu hücreleri, belirtildiği gibi kültürler çok az çoğalması var ile boyanarak hücre çoğalması makinesi, Ki67. Kültürleri, in vitro olarak birkaç gün daha uzun süre kullanılacak ise, non-nöronal hücrelerin prolifere granül nöronların kirlenmeyi azaltmak için Percoll degrade adım dahil olması tavsiye edilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell strainer with 70μm mesh pore	BD Biosciences	352350
Spinal Needle	BD Biosciences	405182	20G x 3-1/2 inches
Poly-D-Lysine mol wt>300,000	Sigma-Aldrich	P1024	Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested.
Percoll	Sigma-Aldrich	P-1644
Penicillin-Streptomycin (100X)	Sigma-Aldrich	P4333
HBSS	Invitrogen	14175-103	Must be calcium and magnesium free.
Neurobasal A-Medium	Invitrogen	10888-022
Glutamax I supplement	Invitrogen	35050-061
B-27 Serum Free Supplement (50x)	Invitrogen	17504-044
12-mm circle coverslips	Carolina Biological	63-3029	These are made in Germany by Deckgluder.
25-mm circle coverslips	Carolina Biological	63-3037	These are made in Germany by Deckgluder.
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical	LK 003150	Kit is good for five isolations.
Permaset scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS6782
Dumont #5 (Dumostar)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS4978
4-well culture dish	Nalge Nunc international	176740
6-well culture dish	Nalge Nunc international	140685