Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi

Elektro füzyon, kısa yüksek voltajlı elektrik darbelerinin yakın bağlamda hücrelere uygulanmasını içerir. Bu videoda, modifiye Adherence.Metodu ile in vitro hücrelerin elektro füzyonu gösterilmektedir. Fare Melanom hücreleri, BF bir üzerinde deneyler yapıldı.

Deneme için şu adımları izleyin. Hücreleri iki ayrı kültür şişesinde% 80 birleşmeye kadar büyütün. Ayrı olarak, her stok çözeltisinden 2,1 mikrolitre ekleyin.

Bir santrifüj tüpünde sırasıyla 10 milimolar C-M-F-D-A veya CMRA'ya üç mililitre Krebs Hess Tamponu. Hücreleri Krebs Hess tamponu ile iki kez durulayın ve ardından yükleme solüsyonlarını şişelere yerleştirin. Yükleme çözeltileri sırasıyla yaklaşık yedi Mikromolar C-M-F-D-A veya CMRA içerir.

Hücreleri kontrollü bir atmosferde 30 dakika inkübe edin. Bu ilk inkübasyon sırasında, bölgeler hücre zarlarından sitozole serbestçe geçer ve burada zar IMP kaynaklı reaksiyon ürünlerine dönüştürülürler. Bu ilk inkübasyondan sonra, hücreleri durulayın ve ardından iki saat daha kültür ortamı ile inkübe edin.

Hücreler, toplama yazılımında soğutulmuş bir CCD kamera ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanılarak gözlemlenir. Uyarma dalga boyunu 548 nanometreye ayarlayın ve C-M-F-D-A yüklü hücreler için CMRA ile yüklenmiş hücrelerin uygun bir bant geçiren filtre tehdidi floresan görüntüsünü seçin. Uyarma dalga boyunu 492 nanometreye ayarlayın ve yeşil floresan görüntü tripsin gözleri için bir bant geçiren filtre seçin ve her iki şişedeki hücreleri sayın ve kırmızı ve yeşil hücreleri bire bir oranında karıştırın, hücre konsantrasyonunu mililitrede 5 milyon hücreye ayarlayın.

Her kuyucuğun ortasına 20 mikrolitrelik bir damla hücre süspansiyonu yerleştirin. 24 çok kuyucuklu bir plakada, hücrelerin tek tabakalı bir şekilde kuyu yüzeyine hafifçe yapışmasına ve kendi aralarında hücre temasları kurmasına izin vermek için hücreleri kontrollü bir atmosferde 20 dakika inkübe edin. Hücreli çok kuyulu hücreleri mikroskop tablasına yerleştirin.

Elektrotları kuyunun dibine yerleştirin ve bunları darbe üretecine bağlayın Optimum elektro füzyonu elde etmek ve hücre canlılığını korumak için yeterli elektrik darbesi parametreleri kullanılmalıdır. Bu parametreler hücre hattına bağlıdır ve ön deneylerde belirlenmelidir. Kültür ortamını çıkarın ve hücre şişmesini indüklemek için hücreleri 350 mikrolitre hipos Miller potasyum fosfat tamponunda bir mililitre ISO omu potasyum fosfat tamponu ile yıkayın.

Elektrik darbeleri uygulamadan önce hücreleri iki dakika hiperozmal tamponda bırakın. Elektrik darbeleri, hücreler maksimum hacimlerine yakın olduğunda uygulanmalıdır. Bu, düzenleyici hacme başlamadan önce.

Deneyimizdeki azalma. Bir hertz'de 100 mikrosaniye süreli sekiz dikdörtgen darbeden oluşan bir tren uygulandı. Nabız Teslimatından Sonra.

Hücreleri 10 dakika sonra 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Yüz kontrastı ve floresan mikroskobu ile belirlenen difüzyon verimi. E rastgele seçilen beş görüş alanında üç görüntü, yüz kontrastı, kırmızı ve yeşil floresan elde edin.

Her birinde, görüntülerin görsel kalitesini ön işleme adımlarına iyileştirmek için görüntü J yazılımındaki her görüntü üçlüsünden üç kanallı görüntü oluşturun, orijinal görüntülere, arka plana, çıkarmaya ve varsayılan parametre setleriyle kontrast geliştirmelerine uygulanabilir. Son olarak, RGB'den griye görüntü J eklentisi kullanılarak üç kanallı görüntüler oluşturulur. Böyle bir görüntüde, istirahat halindeki sitoplazma hücre zarları ile birlikte görülebilir.

Bu nedenle, kırmızı, yeşil ve çift floresan olmak üzere üç hücre tipinin tümünde üç kanallı görüntü sayısında çok az hücre kolayca belirlenebilir. Çift floresan hücrelerin sayısını her görüntüdeki tüm hücrelerin sayısına bölerek çift floresan hücrelerin yüzdesini belirleyin. Füzyon verimi daha sonra çift floresan hücrelerin yüzdesi iki ile çarpımı olarak tanımlanır.

Görünüm hücrelerinin yarısı, aynı renkteki hücreler görüntülendiğinde algılanmadığından.