Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi

Elektrofüzyon, birbirine yakın konumdaki hücrelere kısa süreli yüksek voltajlı elektrik darbeleri uygulanmasını içerir. Bu videoda, modifiye Edişme Yöntemi aracılığıyla hücrelerin in vitro elektrofüzyonunu gösteriyoruz. Deneyler, fare Melanom hücreleri, BF one üzerinde gerçekleştirilmiştir.

Deney için şu adımları izleyin. Hücreleri iki ayrı kültür balonunda %80 konfluense kadar büyütün. Ayrı ayrı, her bir stok çözeltiden 2.1 microliters ekleyin.

Bir santrifüj tüpü içindeki üç mililitre Krebs Hess Tamponu'na sırasıyla 10 milimolar C-M-F-D-A veya CMRA ekleyin. Hücreleri iki kez Krebs Hess tamponu ile durulayın ve ardından yükleme solüsyonlarını flasklara aktarın. Yükleme solüsyonları sırasıyla yaklaşık yedi Mikromolar C-M-F-D-A veya CMRA içerir.

Hücreleri kontrollü bir atmosferde 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu ilk inkübasyon sırasında bölgeler, hücre membranlarından sitozole serbestçe geçer ve burada membran IMP geçirgen reaksiyon ürünlerine dönüşürler. Bu ilk inkübasyondan sonra, hücreleri durulayın ve ardından kültür medyumu ile iki saat daha inkübe edin.

Hücreler, görüntüleme yazılımına sahip, soğutmalı bir CCD kamera ile donatılmış floresans mikroskobu kullanılarak gözlemlenir. Eksitasyon dalga boyunu 548 nanometreye ayarlayın ve CMRA yüklü hücrelerin floresans görüntüsü için uygun bir bant geçiren filtre seçin. C-M-F-D-A yüklü hücreler için eksitasyon dalga boyunu 492 nanometreye ayarlayın ve yeşil floresans görüntüsü için bir bant geçiren filtre seçin; her iki flasktaki hücreleri sayın ve kırmızı ile yeşil hücreleri bir bire oranında birbirine karıştırarak hücre konsantrasyonunu mililitre başına 5 milyon hücreye ayarlayın.

Her bir kuyucuğun ortasına 20 µL hücre süspansiyonu damlatın. Hücrelerin kuyucuk yüzeyine hafifçe tutunup bir monotaba yayılmalarını ve kendi aralarında hücre temasları kurmalarını sağlamak için, hücreleri 24'lü çok kuyucuklu plakada kontrollü bir atmosferde 20 dakika boyunca inkübe edin. Hücrelerin bulunduğu çok kuyucuklu plağı mikroskop tablasına yerleştirin.

Elektrotları kuyucuğun altına yerleştirin ve pulse jeneratörüne bağlayın. Optimal elektrofüzyonu sağlamak ve hücre canlılığını korumak için uygun elektrik darbesi parametreleri kullanılmalıdır. Bu parametreler hücre hattına bağlıdır ve ön deneylerle belirlenmelidir. Kültür ortamını uzaklaştırın ve hücre şişmesini indüklemek amacıyla hücreleri 1 mL izotonik potasyum fosfat tamponu ve ardından 350 µL hipotonik potasyum fosfat tamponu ile yıkayın.

Elektrik darbeleri uygulanmadan önce hücreleri iki dakika boyunca hiperozmal tamponda bekletin. Elektrik darbeleri, hücreler maksimum hacimlerine yakınken uygulanmalıdır. Yani, düzenleyici hacim kontrolüne başlamadan önce uygulanmalıdır.

Deneyimizdeki azalma. Bir hertz frekansında, 100 mikrosaniye süreli sekiz dikdörtgen palslik bir dizi uygulandı. Pals uygulamasının ardından.

10 dakika bekledikten sonra hücreleri 10 dakika boyunca rahatsız etmeyin. Difüzyon verimini faz kontrastlı ve floresan mikroskop aracılığıyla belirleyin. Rastgele seçilmiş beş farklı görüş alanında faz kontrastlı, kırmızı ve yeşil floresan olmak üzere üç görüntü elde edin.

Görüntülerin görsel kalitesini artırmak amacıyla, ImageJ yazılımında her görüntü üçlüsünden üç kanallı görüntüler oluşturulmuştur; böylece orijinal görüntülere ön işleme adımları olan arka plan çıkarma ve varsayılan parametre setleriyle kontrast iyileştirmeleri uygulanabilmiştir. Son olarak, RGB to gray ImageJ eklentisi kullanılarak üç kanallı görüntüler birleştirilmiştir. Bu şekilde oluşturulan görüntüde, dinlenme halindeki sitoplazma hücre membranları ile birlikte görülebilmektedir.

Böylece, üç kanallı görüntüde az sayıda hücre kolayca belirlenebilir; kırmızı, yeşil ve çift floresan özelliğe sahip üç hücre tipi de sayılır. Her görüntüdeki toplam hücre sayısına, çift floresan hücre sayısının bölünmesiyle çift floresan hücrelerin yüzdesi belirlenir. Füzyon verimi, çift floresan hücrelerin yüzdesinin iki ile çarpılmasıyla tanımlanır.

Hücreler aynı renk görünümlerine sahip olduğunda, görüntüleme hücrelerinin yarısı tespit edilemediğinden.