Name: Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Öğrenin fare melanoma hücrelerinde elektrofüzyon yöntemini; floresan mikroskopi ile füzyon verimini görselleştirin ve hibrit hücre oluşturma protokolünü keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Slovenya Araştırma Ajansı (proje J2-9764 ve program P2-0249) tarafından desteklenmiştir. Bu video &quot;Elektroporasyon tabanlı Teknolojileri ve Tedaviler&quot;, Slovenya Ljubljana Üniversitesi Elektrik Mühendisliği Fakültesi tarafından düzenlenen bilimsel atölye ve lisansüstü ders, ek malzeme temsil eder.

I. Hücre izci CMFDA ve CMRA hücreleri yükleme <ol><li> Fare melanom hücre hattı (B16-F1) önceden hazırlanmış hücreleri üzerinde deneyler yapıldı. Hücreler% 70-80% 10 fetal sığır serumu, 0.15 mg / ml 'lik L-glutamin, 16 mg ile desteklenmiş DMEM kültür ortamı izdiham (Dulbecco'nun modifiye Eagle orta) için iki ayrı 25 cm 2 kültür şişeler (DYP, ZDA ) yetiştirilen / ml gentamisin (Sigma-Aldrich, Almanya), 200 adet / ml crystacillin (Pliva'nın Hırvatistan), 37% 5 CO 2 inkübe ° C </li><li> Orijinal boya 50 mikrogram 10.76 ul ul ve DMSO (Sigma-Aldrich, Almanya) 9 (sırasıyla, Yeşil CMFDA ve Turuncu CMRA) ekleyerek iki Hücre izci 10 mM stok solüsyonları (Invitrogen, ABD) hazırlayın Invitrogen flakon. Stok çözelti 4 ° C'de birkaç ay buzdolabında saklanabilir. DMSO kristallerin çözünmesi kadar, deneyler başlamadan önce ısınmak çözüm. </li><li> Bikarbonat-Krebs-HEPES tamponu (130 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO 4, 1.2 mM KH 2 PO 4, 11.7 mM D-glukoz, 1.3 mM CaCl 2, 10 mM Hepes, pH 7.4) hazırlayın. Iki bikarbonat ücretsiz Krebs-HEPES tamponu 3 ml 15 ml Eppendorf tüpleri ayrı ayrı her bir stok solüsyonu 2.1 ul karışımı (10 mM CMFDA veya CMRA, sırasıyla). Bu yaklaşık çalışmada 7 mcM CMFDA (ya da CMRA) içeren bir "yükleme çözüm" ortaya çıkarır. </li><li> Bikarbonat ücretsiz Krebs-HEPES tamponu ile hücreler iki kez durulayın ve sonra şişeler içine çözümler yükleme eklemek. 37% 5 CO 2, 30 dakika boyunca hücrelerinin inkübe ° C. Bu ilk kuluçka reaktifleri hücre zarları aracılığıyla serbestçe geçiş sırasında, ama bir kez hücre içinde, reaktifler hücre geçirgenliği olmayan floresan reaksiyon ürünler haline dönüştürülür. </li><li> 37 ilk inkübasyondan sonra, durulama ve% 5 CO 2, iki saat boyunca başka bir kültür ortamı ile hücreleri inkübe ° C </li><li> Hem şişeler hücrelerin Trypsinize (CMFDA ve CMRA yüklü) ve 50 ml santrifüj tüpüne bir oranı 1:1 (DYP, ZDA) birlikte, kırmızı ve yeşil hücreleri karışımı. DMEM orta ile seyreltme veya santrifüj ile konsantrasyon 5 x 10 6 hücre / ml hücre konsantrasyonu ayarlayın. 24 multiwell plaka (DYP, ZDA) her kuyuda bir hücre süspansiyonu 20 ul damla yerleştirin. 37 ° C'de 20 dakika için onları biraz daha iyi yüzeyine tutunur ve hücre temas kurmak için izin vermek için% 5 CO 2 hücre inkübe edin. </li></ol> II. Elektrofüzyon <ol><li> (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mm MgCl 2, 75 mM sukroz) isoosomolar potasyum fosfat tamponu hazırlayın (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mm MgCl 2, 250 mM sukroz) ve hypoosmolar potasyum fosfat tamponu . </li><li> Iyi altındaki hücreleri mikroskop aşamada, pozisyon üzerine elektrotlar multiwell yerleştirin ve darbe jeneratörü bağlayın. </li><li> Isoosomolar potasyum fosfat tamponu 1 ml hücreleri yıkayın. Hücre şişmesi neden için 350 ul hypoosmolar potasyum fosfat tamponu ekleyin. Tampon elektrotlar kapsamalıdır. </li><li> Hücreleri elektrik darbeleri uygulamadan önce 2 dakika hypoosmolar tampon içinde bırakın. Osmotik hücrelerinin iç ve dış arasındaki dengesizlik nedeniyle hücre içine su molekülleri bu kez akını sırasında hücre hacmi bir artışa neden olur. Hücreler maksimum hacim yakın Elektrik bakliyat düzenleyici seviyesini azaltmak başlamadan önce uygulanmalıdır. </li><li> Optimal elektrofüzyon ulaşmak ve hücre canlılığını korumak için, elektrik darbeleri optimal parametreleri kullanılmalıdır. Bunlar [1] kullanılan hücre hattı bağlıdır. Bu deneyde, 8 dikdörtgen darbeler (1 Hz 100 s süresi her) bir tren elektroporasyon cihazı (bizim durumumuzda Cliniporator, Igea, İtalya) ile, her bir örnek uygulanır. Darbeleri iyi kontrolü dışında, bir elektrik alanı, her bir kuyunun elektrot arasındaki yaklaşık 1200 V / cm, 0.8 mm çap ve aralarında 5 mm mesafe ile iki paralel Pt / Ir tel elektrotlar teslim edilir. </li><li> 10 dakika sonra nabız teslimat için rahatsız hücreleri bırakın. Floresan, faz kontrast mikroskobu ile füzyon verimi belirleyin. </li></ol> III. Görüntü edinimi ve füzyon verimi belirlenmesi <ol><li> Hücreleri bir amacı (x20) ve soğutmalı CCD kamera (VisiCam 1280, Visitron, Almanya) ile donatılmış bir floresan mikroskobu (bizim durumumuzda Zeiss AxioVert 200, Zeiss, Almanya) kullanılarak görülmektedir. Görüntüleri MetaMorph 7.1.1 (Moleküler Cihazlar, ABD) satın alınan, ancak diğer benzer satın alma yazılımı da kullanılabilir. CMFDA 548 nm'de 492 nm'de monokromatör (Polychrome IV, Visitron, Almanya) ve CMRA heyecanlı. CMFDA ve CMRA floresan (D605/55m C iki emisyon 535 nm 'de merkezlenmiş filtreler, bir (HQ535/30m CMFDA için) ve 510 nm dalga boyunda diğer merkezli kullanarak elde edilirMRA, Chroma, ABD) hem de. Dikroik ayna (Q515LP) kanal çapraz tartışma engelledi. </li><li> Her iyi beş rasgele seçilmiş alanlar için üç görüntüleri (faz kontrast, kırmızı ve yeşil floresan) edinin. Her görüntünün üçlü üç kanal görüntüleri oluşturun. Böyle bir görüntüde floresanlama sitoplazma, hücre zarları ile birlikte görülebilir. Sigortalı hücreleri böylece [Şekil 1] kolayca tespit edilebilir. </li><li> Her üç kanallı görüntü her üç tip hücre (kırmızı, yeşil ve dually floresan) güvenin. Her görüntünün tüm hücrelerin sayısı ile ikili olarak floresan hücrelerinin sayısına bölünmesiyle dually floresan hücrelerin yüzdesi belirleyin. Fusion verim yarısı erimiş hücreler tespit olmadığı için 2 ile çarpılır dually floresan hücrelerin yüzdesi olarak tanımlanır (aynı renk sigorta hücreleri). </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1991/1991fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 elektrofüzyon sonra B16F1 hücrelerinin üç kanal mikroskopi görüntü: faz kontrast, CMRA floresan (548 nm eksitasyon) ve CMFDA floresans (492 nm eksitasyon), objektif büyütme 20x

<ol><li>Čemazar, M., Jarm, T., Miklavčič, D., Maček-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Serša, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+electric-field+intensity+on+electropermeabilization+and+electrosensitivity+of+various+tumor-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Electro.+Magnetobiol%22%5BJournal%5D)">Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro.</a> Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).</li>
<li>Trontelj, K., Reberšek, M., Kandušer, M., čurin šerbec, V., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+bulk+cell+electrofusion+in+vitro+for+production+of+human-mouse+heterohybridoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells.</a> Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).</li>
<li>Rols, M. -P., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+electrically+induced+permeabilization+and+fusion+of+Chinese+hamster+ovary+cells+by+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure.</a> Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).</li>
<li>Neil, G., Zimmermann, U. Electrofusion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeil%2C+G+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 220, 174-196 Forthcoming.</li>
<li>Abidor, I. G., Li, L. -H., Hui, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+cell+pellets%3A+II.+Osmotic+properties%2C+electroporation%2C+and+related+phenomena%3A+Membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions.</a> Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).</li>
<li>Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+facilitated+cell-cell+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanically facilitated cell-cell electrofusion.</a> Biophys J. 67 (4), 1574-1581 (1994).</li>
<li>Ramos, C., Bonefant, D., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hybridization+by+electrofusion+on+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell hybridization by electrofusion on filters.</a> Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).</li>
<li>Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+high-throughput+cell+electrofusion+in+a+microelectrode-array+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip.</a> Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).</li>
<li>Ušaj, M., Trontelj, M., Kandušer, M., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+dynamics+and+viability+of+cells+exposed+to+hypotonic+treatment+and+electroporation+for+electrofusion+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Radiol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization.</a> Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).</li>
<li>Teissié, J., Ramos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+electric+field+pulse+induced+long-lived+permeabilization+and+fusogenicity+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes.</a> Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).</li>
</ol>

Non-spesifik, örneğin, dış elektrik alanları, sigorta hücre zarlarının biyoloji, biyoteknoloji, tıp ve araştırma yeteneği önemlidir. Böyle bir nonspesifik füzyon çok değerli hibrid hücreler ve monoklonal antikorlar gibi ürünler, üretim sağlar ve füzyon [2] temel mekanizmaları hakkında bilgi sağlar. Elektrofüzyon düzgün farklı hücre türlerine ayarlanmış olabilir çünkü potansiyel olarak çok etkili bir yöntemdir. Yakın fiziksel temas hücreleri kendi fusogenic haline getirilir Elektrofüzyon (füzyon eğilimli) yüksek voltajlı elektrik darbeleri ile elde edilir. Elektrofüzyon verimliliği elektrofüzyon sürecinin iki bölümden etkileyen çeşitli parametreler bağlıdır. Elektrofüzyon sürecinin ilk bölümü hücreleri arasındaki yakın fiziksel temas başarı, farklı yöntemler ile elde edilebilir [3-8]. Bağlılık yöntemi (izdiham için büyüyen hücreleri) verimli hücreleri arasındaki büyük bölgelerde kendiliğinden kurulan hücre kişilere bağlı olarak kullanılabilir, fakat birçok çekirdekleri ile çok büyük erimiş hücreler üretir. Hayatta kalmak için daha fazladır ve tomurcuklanmaya küçük hücreleri (çekirdekleri 2 ila 5), ​​(Şekil 1) elde edilir, modifiye bağlılık yöntemi kullanarak. Hücreleri arasındaki temas da deney [9] osmotik tedavisinde kullanılan nedeniyle, hücrelerin ozmotik şişme yarar. Elektrofüzyon sürecinin ikinci bölümü, hücre zarlarının fusogenic devletin başarısıdır. Fusogenic devlet membran electropermeabilized devlet (hücreler non-spesifik normalde sağlam zarından geçemez moleküllere permeabilize) ile ilişkilidir ve elektrik darbeleri aynı parametreler (genlik, uzunluk, sayı ve frekans) tarafından yönetilir [10] . Optimum elektroporasyon için gerekli elektriksel parametrelerin değerleri [1] ve elektrofüzyon farklı hücreler arasında farklılık hücrelerin boyutu ve biyolojik özellikleri bağlıdır. Elektrik parametreleri böylece, füzyon elde etmek için, füzyon ortağı olarak kullanılan farklı hücre hatları, için optimize edilmesi gerekir.

<table><tbody><tr><td>CMRA</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td>Sitozolik floresan boya</td></tr><tr><td>CMFDA</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td>Sitozolik floresan boya</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM </td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modifiye Eagle&amp;rsquo;s besiyeri</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>kristasilin</td><td>Reaktif</td><td>Pliva</td><td>625110</td><td>antibiyotik</td></tr><tr><td>gentamisin</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>antibiyotik</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reaktif</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A124873 927</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4248</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reaktif</td><td>Fluka</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reaktif</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A154336 908</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoz</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>sukroz</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>Elektrik darbe jeneratörü</td><td>Ekipman</td><td>IGEA</td><td></td><td>Cliniporator VITAE</td></tr><tr><td>Çok kuyucuklu plaka</td><td>Ekipman</td><td>Techno Plastic Products</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>50 ml santrifüj tüpü</td><td>Ekipman</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml santrifüj tüpü</td><td>Ekipman</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; kültür flaskı</td><td>Ekipman</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>Elektrotlar</td><td>Ekipman</td><td>Özel Üretim</td><td></td><td>Pt/Ir</td></tr></tbody></table>

hücre elektrofüzyon floresan mikroskop ile görüntülendi

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Hücre elektrofüzyon hibrit hücrelerinin, insan tedavisi için hazırlamak için kullanılan güvenli bir non-viral ve kimyasal olmayan bir yöntemdir. Elektrofüzyon yakın temas içinde olan hücrelere kısa yüksek voltajlı elektrik darbeleri uygulama içerir. Kısa, yüksek voltajlı elektrik darbeleri Uygulama hücre plazma membranlar istikrarsızlaştırma neden olur. Istikrarsızlaştırdı membranlar farklı moleküller için daha geçirgen ve aynı zamanda herhangi bir komşu istikrarsızlaştırdı membranlar ile füzyonu eğilimli. Elektrofüzyon böylece çok farklı hücreler non-spesifik bir füzyon sağlamak için uygun bir yöntemdir<em&gt; In vitro</em&gt;. Elektrik alanı istikrarsızlaştırdı füzyon, hücre zarları, elde etmek için, kendi çift katlı lipit katmanını birleştirme ve dolayısıyla sitoplazma izin yakın bir temas halinde olmalıdır. Bu video, hücre verimli elektrofüzyon göstermektedir<em&gt; In vitro</em&gt; Modifiye bağlılık yöntemi sayesinde. Bu yöntemde, hücreler, sadece biraz daha iyi yüzey takmak için izin verilir, bu orta takas ve hücreleri hala küresel şekli korumak olabilir. Fusion görselleştirme, farklı floresan hücre izci boyalarla hücrelerinin sitoplazmasında öncesi etiketleme tarafından değerlendirilir; hücrelerin yarısı, turuncu CMRA ve yeşil CMFDA ile diğer yarısı ile etiketlenir. Fusion verimi sayısı iki ile çarpılır tüm hücreleri ile bölünmüş dually floresan hücrelerinin sayısı olarak belirlenir.

Bu video hücrelerin verimli elektrofüzyon göstermektedir<em&gt; In vitro</em&gt; Elektroporasyon ve floresan mikroskobu ile erimiş hücreler görselleştirme sonraki algılama kullanarak modifiye bağlılık yöntem sayesinde.

Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi

Hücre elektrofüzyonu, insan terapisi için hibrit hücreler hazırlamak amacıyla kullanılabilen güvenli, viral olmayan ve kimyasal olmayan bir yöntemdir. Elektrofüzyon ...

Elektrofüzyon, birbirine yakın konumdaki hücrelere kısa süreli yüksek voltajlı elektrik darbeleri uygulanmasını içerir. Bu videoda, modifiye Edişme Yöntemi aracılığıyla hücrelerin in vitro elektrofüzyonunu gösteriyoruz. Deneyler, fare Melanom hücreleri, BF one üzerinde gerçekleştirilmiştir.Deney için şu adımları izleyin. Hücreleri iki ayrı kültür balonunda %80 konfluense kadar büyütün. Ayrı ayrı, her bir stok çözeltiden 2.1 microliters ekleyin.Bir santrifüj tüpü içindeki üç mililitre Krebs Hess Tamponu'na sırasıyla 10 milimolar C-M-F-D-A veya CMRA ekleyin. Hücreleri iki kez Krebs Hess tamponu ile durulayın ve ardından yükleme solüsyonlarını flasklara aktarın. Yükleme solüsyonları sırasıyla yaklaşık yedi Mikromolar C-M-F-D-A veya CMRA içerir.Hücreleri kontrollü bir atmosferde 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu ilk inkübasyon sırasında bölgeler, hücre membranlarından sitozole serbestçe geçer ve burada membran IMP geçirgen reaksiyon ürünlerine dönüşürler. Bu ilk inkübasyondan sonra, hücreleri durulayın ve ardından kültür medyumu ile iki saat daha inkübe edin.Hücreler, görüntüleme yazılımına sahip, soğutmalı bir CCD kamera ile donatılmış floresans mikroskobu kullanılarak gözlemlenir. Eksitasyon dalga boyunu 548 nanometreye ayarlayın ve CMRA yüklü hücrelerin floresans görüntüsü için uygun bir bant geçiren filtre seçin. C-M-F-D-A yüklü hücreler için eksitasyon dalga boyunu 492 nanometreye ayarlayın ve yeşil floresans görüntüsü için bir bant geçiren filtre seçin; her iki flasktaki hücreleri sayın ve kırmızı ile yeşil hücreleri bir bire oranında birbirine karıştırarak hücre konsantrasyonunu mililitre başına 5 milyon hücreye ayarlayın.Her bir kuyucuğun ortasına 20 µL hücre süspansiyonu damlatın. Hücrelerin kuyucuk yüzeyine hafifçe tutunup bir monotaba yayılmalarını ve kendi aralarında hücre temasları kurmalarını sağlamak için, hücreleri 24'lü çok kuyucuklu plakada kontrollü bir atmosferde 20 dakika boyunca inkübe edin. Hücrelerin bulunduğu çok kuyucuklu plağı mikroskop tablasına yerleştirin.Elektrotları kuyucuğun altına yerleştirin ve pulse jeneratörüne bağlayın. Optimal elektrofüzyonu sağlamak ve hücre canlılığını korumak için uygun elektrik darbesi parametreleri kullanılmalıdır. Bu parametreler hücre hattına bağlıdır ve ön deneylerle belirlenmelidir. Kültür ortamını uzaklaştırın ve hücre şişmesini indüklemek amacıyla hücreleri 1 mL izotonik potasyum fosfat tamponu ve ardından 350 µL hipotonik potasyum fosfat tamponu ile yıkayın.Elektrik darbeleri uygulanmadan önce hücreleri iki dakika boyunca hiperozmal tamponda bekletin. Elektrik darbeleri, hücreler maksimum hacimlerine yakınken uygulanmalıdır. Yani, düzenleyici hacim kontrolüne başlamadan önce uygulanmalıdır.Deneyimizdeki azalma. Bir hertz frekansında, 100 mikrosaniye süreli sekiz dikdörtgen palslik bir dizi uygulandı. Pals uygulamasının ardından.10 dakika bekledikten sonra hücreleri 10 dakika boyunca rahatsız etmeyin. Difüzyon verimini faz kontrastlı ve floresan mikroskop aracılığıyla belirleyin. Rastgele seçilmiş beş farklı görüş alanında faz kontrastlı, kırmızı ve yeşil floresan olmak üzere üç görüntü elde edin.Görüntülerin görsel kalitesini artırmak amacıyla, ImageJ yazılımında her görüntü üçlüsünden üç kanallı görüntüler oluşturulmuştur; böylece orijinal görüntülere ön işleme adımları olan arka plan çıkarma ve varsayılan parametre setleriyle kontrast iyileştirmeleri uygulanabilmiştir. Son olarak, RGB to gray ImageJ eklentisi kullanılarak üç kanallı görüntüler birleştirilmiştir. Bu şekilde oluşturulan görüntüde, dinlenme halindeki sitoplazma hücre membranları ile birlikte görülebilmektedir.Böylece, üç kanallı görüntüde az sayıda hücre kolayca belirlenebilir; kırmızı, yeşil ve çift floresan özelliğe sahip üç hücre tipi de sayılır. Her görüntüdeki toplam hücre sayısına, çift floresan hücre sayısının bölünmesiyle çift floresan hücrelerin yüzdesi belirlenir. Füzyon verimi, çift floresan hücrelerin yüzdesinin iki ile çarpılmasıyla tanımlanır.Hücreler aynı renk görünümlerine sahip olduğunda, görüntüleme hücrelerinin yarısı tespit edilemediğinden.

cell-electrofusion-visualized-with-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz sinek larvaları konfokal mikroskobu ile floresan boyalar kullanarak canlı bir roman Tersyüz doku hazırlanması Glia nöromüsküler sinapsların yapısal özellikleri nitelendirdi. Biz HRP için flüoresan primer antikor ile canlı nöron terminalleri etiketli ve floresan Dextrans perisynaptic alan görüntülendi.

Canlı görselleştirme Drosophila</emFloresan Boyalar> Glial nöromüsküler Kavşağı

Burada izlenir ve sayısal, fonksiyonel moleküler kompleksler tespit sağlamak için canlı bakteri hücreleri tek-molekül floresan mikroskopi gerçekleştirmek için protokolleri göstermektedir.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

CLEM tekniği enjekte edilen moleküller tarafından etkilenen membranlar, organeller ve hücre içi yapıların ultrastrüktürel morfolojisini analiz etmek için adapte edilmiştir. Bu yöntem çok nanometre çözünürlükte milimetre izin mikromanipülasyon / mikroenjeksiyon güçlü teknikleri, konfokal floresan mikroskopi ve elektron mikroskopi birleştirir. Bu teknik, uygulamaların geniş bir çeşitliliği için müsait.

Bir Aracı Olarak Korelatif Işık ve Elektron Mikroskobu (CLEM) microinjected Moleküller ve Ökaryotik Alt hücresel Hedefler Visualize&#39;a

Kaynak: Aigrain, L. ve diğerleri. Elektroporasyon yoluyla canlı mikroorganizmalarda floresan biyomoleküllerin içselleştirilmesi ve gözlemlenmesi.  J. Vis. Exp. (2015)Video, elektroporasyon kullanılarak floresan biyomoleküllerin elektro yetkili mikrobiyal hücrelere nasıl teslim edildiğini gösteriyor. Süreç, florofor etiketli DNA veya proteinlerin soğutulmuş hücre süspansiyonuna eklenmesiyle başlar. Daha sonra yüksek voltajlı bir darbe uygulanarak geçici membran gözenekleri oluşturulur ve...

Floresan Biyomoleküllerin Bakteriyel Hücrelere Elektroporasyon Tabanlı Teslimatı

Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

Dört boyutlu (4D) görüntüleme omurgalı sinir terminalleri canlı endozomlar iki tip arasındaki davranış ve etkileşimleri incelemek için kullanılmaktadır. Bu küçük yapıların hareketi gibi endozom füzyon ve ekzositoz gibi olayların onay izin, üç boyutlu olarak karakterize edilir.

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Bu protokol, fare kas liflerinde floresan olarak işaretlenmiş proteinleri tanıtmak ve eksprese etmek için elektroporasyonu kullanır. Elektroporasyondan sonra geri kazanımın ardından lifler izole edilir. Tek tek lifler daha sonra kas yapısını görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenir.

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Bu protokol bırakmak Förster rezonans enerji transferi ve floresan mikroskopi Imaging ömür boyu göre SNARE proteinlerin karmaşık oluşumu nicel görselleştirme için yeni bir yöntem açıklanır.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Bu protokolün amacı, melez hücreler oluşturmak için iki farklı hücre türünü birleştirmektir. Erimiş hücrelerin floresan mikroskobu analizi hücresel organellerin menşe hücresini izlemek için kullanılır. Bu tetki, hücre yapısı nın ve fonksiyonun hücre füzyonu ile tedirginlik lere nasıl tepki verdiğinin araştırılması için kullanılabilir.

Hücresel Yapı ve Fonksiyonun Perturbasyonu için Genom Düzenlenmiş Hücre Hatları hücre-hücre Füzyon

Bu protokol, sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu tespit etmek için konfokal bir görüntüleme tekniğini tanımlar. Bu füzyon modları arasında 1) füzyon gözenek açma ve kapama içeren yakın füzyon (öpüş ve koş olarak da adlandırılır), 2) füzyon gözenek açılmasını ve açılan gözenekin korunmasını içeren stay-füzyon ve 3) kaynaşmış vezikül büzülmesini içeren büzülme-füzyon bulunur.

Adrenal Kromafin Hücrelerinde Üç Füzyon Gözenek Dinamiği Modunu Ölçmek için Konfokal Mikroskopi

Öğrenin fare melanoma hücrelerinde elektrofüzyon yöntemini; floresan mikroskopi ile füzyon verimini görselleştirin ve hibrit hücre oluşturma protokolünü keşfedin.

Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi

Daha fazla video keşfet