Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

Transgenik hayvanlarda floresan raportörlerin ekspresyonu, canlı hastalık modellerinde deneysel manipülasyonlara hücresel tepkileri takip etmeyi mümkün kılar. Burada, seçici hücre kaybı, yüksek çözünürlüklü çok renkli konfokal zebra balıklarında farmakolojik olarak indüklenir. Hedeflenen hücrelerin ve yakın komşuların görüntüleri, hemen sonrasından önce ve hemen sonra elde edilir ve İlaç tedavisini takip eden aralıklı aralıkları, görüntü analizi, endojen kök hücre popülasyonlarının aktivasyonunu ve ardından iyileşme aşamasında hedeflenen hücrelerin değiştirilmesini gösterir.

Bu yöntem, rejenere biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin Gizli hücre tiplerini yenilemek için kullanılan hücresel ve moleküler mekanizmalar nelerdir Çiftleşmelerden toplanan transgenik yumurtaları döllenmeden 16 saat sonra 0.3 x danio çözeltisi içeren bir Petri kabına aktararak başlayın. İLGİLİ dokuda herhangi bir pigmentasyon belirtisi olmadan önce tirozin ACE aktivitesini inhibe etmek için PTU EKLEYIN. Embriyo albino değilse, embriyoları 28.5 santigrat derecede inkübe edin.

Raportörler belirginleştikten sonra, Petri kabını bir floresan stereo zoom mikroskobunun altına yerleştirin ve istenen transgen ekspresyonu için sıralayın. Görüntülemeden önce. Embriyo ortamında% 0.5 düşük eriyik aeros montaj çözeltisi hazırlayın ve 40 santigrat derecede saklayın.

Gerekirse trica ve PTU ekleyin. Yavaşça karıştırın ve 40 santigrat dereceye geri dönün. Balıkları trica içeren embriyo ortamına yerleştirerek uyuşturun.

Yaklaşık üç dakika boyunca balıklar tepkisiz hale gelecektir. Bir mikro pipet kullanarak dokunmak için, tek tek balıkları yaklaşık 30 mikrolitre anestezik solüsyon hacminde kesilmiş bir pipet ucuna çekin. Ardından, pipeti ters çevirin ve balığın dibe çökmesine izin verin.

Ucu montaj çözeltisine dokundurun ve yerçekimi ile aktarmalarına izin verin. Agro'yu tekrar kullanabilmesi için seyreltmemeye dikkat edin. Kalan anestezik solüsyonu mikro pipetten atın.

Sonra aynı ucu kullanarak balığı bir Petri kabına aktarın. Yaklaşık 30 mikrolitrelik montaj solüsyonunda, balığı, ilgilenilen bölge aeros damlacığında ortalanacak şekilde nazikçe yönlendirin. Aeros katılaşana kadar balığın istenen yönde kaldığından emin olun.

İstenirse tek bir Petri kabına birden fazla balık monte edilebilir. Aeros katılaştıktan sonra, balığı konfokal mikroskop aşamasına taşıyın ve balıklar tamamen suya batırılana kadar tabağa trica artı veya eksi PTU içeren embriyo ortamını yavaşça ekleyin. Görüntüleme yazılımını açın ve hücresel ve/veya moleküler ayrıntıların en iyi şekilde görüntülenmesi için ilgilenilen bölgeye odaklanın.

Yazılımda yüksek sayısal açıklıklara sahip uzun çalışma mesafesi hedefleri kullanın. Arama listesinden uygun flora dörtlüsünü seçin. Spektral ayara tıklayın ve emisyon aralıklarında ayarlamalar yapın.

Raportör sinyallerinin temiz bir şekilde ayrılmasını sağlamak ve sinyal-gürültü oranlarını en üst düzeye çıkarmak için. Yazılım tanımlı ön ayarların doğru şekilde ayarlandığından emin olmak için açılır menüden uygun hedefi seçin. Lazerleri odaklamak ve güç seviyelerini ayarlamak için, arama tablosundan her kanal için piksel doygunluğunu gösteren bir çıktı seçin.

Ardından, istenen görüntü kalitesini elde etmek için dedektör hassasiyetini ayarlayın, görüntü yoğunluğu kabul edilebilir olana kadar lazer çıkışını kademeli olarak yükseltin. İlgilenilen bölgede piksel doygunluğundan kaçının ve lazer seviyelerini mümkün olduğunca düşük tutun. Foto ağartma ve fototoksisite sorunlarını azaltmak için.

Tüm görüntüleme kanallarını izlerken lazerleri manuel olarak açıp kapatarak her lazer çizgisinin yalnızca uygun kanalda algılanabilir sinyal ürettiğinden emin olun. Karışma belirgin değilse, tüm kanallar aynı anda alınabilir. Ardından, yakınlaştırma ve döndürme işlevlerini kullanarak ilgilenilen alanı çerçeveleyin.

Ardından, daha yüksek tarama hızlarını kullanarak tarama hızını ve görüntü boyutunu ayarlayın, lazerde kalma süresini en aza indirir ve zamansal çözünürlüğü artırır. Z boyutu adım boyutunu deneysel ihtiyaçlara göre ayarlayın. Burada, retina dokusunun yedi optik bölümünü görüntülemek için 10 mikronluk bir adım boyutu kullanılır.

Uygun ayarlar belirlendikten sonra Zack görüntülerini alın ve kaydedin. Sonra bir sonraki balığa geçin. Ekteki yazılı belgedeki talimatlara göre ardışık günler boyunca hücresel değişiklikleri izlemek için seri yakalama ve bırakma görüntülemesi gerçekleştirilebilir.

Çok raporlu bir görüntüleme deneyi gerçekleştirirken, iyi ayrılmış, spektral zemin zeminleri kullanmak en iyisidir, ancak bu her zaman pratik değildir. Burada, üst üste binen uyarma ve emisyon profillerine sahip zemin katlarını ayırmak için açık kaynaklı yazılım görüntüsü J'yi kullanarak basit bir görüntü çıkarma yöntemi gösteriyoruz. Bizim durumumuzda, GFP ve YFP.

Bu videoda açıklanan zaman çizelgeleri görüntüleme teknikleri, retinal bipolar nöronların ablasyonu ve rejenerasyonu sırasında GFP etiketli retinal kök hücreleri izlemek için kullanılmıştır Spektral ayırma gerçekleştirmek için, üst üste binen kat dörtlülerinin sırasıyla bağımsız olarak ve kısmen ayrılmasına izin veren sıralı görüntüleme modlarını ve değişken bariyer filtre ayarlarını kullanarak görüntüleri toplayın. Görüntüler alındıktan sonra, içe aktarma aracını başlatmak üzere görüntü dosyalarını açmak için ImageJ loci bio formas içe aktarmayı kullanın. İlgilendiğiniz dosyayı görüntü J penceresine sürükleyin.

Üç TP eklentisini hizalamayı başlatmak için içe aktarma penceresindeki kanalları böl onay kutusunu kullanarak kanalları ayrı yığınlara bölün. Eklentilere tıklayın, ardından yığınları hizalayın. Ardından üç tp'yi hizalayın.

Uygun çıkarma işlemini sağlamak için yığınlar hizalanmalıdır. İlk açılan kutuda başvuru yığınını, ikinci kutuda ise yanlış hizalanmış yığını seçin. XY göreli köken kullan ve Z göreli köken kullan kutularını işaretleyin ve Tamam'a tıklayın.

Hizalama işlemini başlatmak için birim kayıt düğmesine tıklayın. Hizalama parametrelerini içeren yeni bir pencere açılacaktır. Tamam'a tıklayın.

Bu bölüm, eklentinin distribütörü tarafından optimize edilmiştir, bu nedenle herhangi bir değişiklik yapılması gerekmez. İşiniz bittiğinde, hizalanmış bir yığın penceresi görünecektir. Çıkış penceresini açmak için hizalanmış pencereden çıktıyı seçin.

Bu pencere de optimize edilmiştir ve herhangi bir değişiklik gerektirmez. Tamam'a tıklayın. Çalışma alanında, dosya Başlığının sonuna hizalanmış olarak eklenmiş yeni bir yığın görünür.

Görüntü hesaplayıcıyı kullanarak karışmayı kaldırmak için, işleme ve ardından görüntü hesaplayıcıya tıklayın. Görüntü bir açılır kutusunda çıkarılacak yığını ve çıkarma işleminde kullanılacak yığını seçin. İkinci resim açılır kutusunda, işlem açılır kutusunda çıkar'ı seçin ve Tamam'a tıklayın.

Görüntü J, yığını işlemenizi isteyecektir. Evet'i seçin. Çakışan kanallar arasındaki karışmayı kaldıran yeni bir yığın görünmelidir.

Hizalama ve çıkarma işlemlerinden önce aynı görüntü yapısını yeniden oluşturmak için yığınları birleştirin. Araç, kanal araçları penceresinde birleştirilmiş kanalları seçerek, en fazla dört yığının bir hiper yığında birleştirilmesine izin verir. Son olarak, kanalları renklendirin, parlaklık ve kontrastı ayarlayın ve nitro redüktazın hedeflenen kaybını ve rejenerasyonunu incelemek için dosyaları tiff olarak kaydedin.

M kiraz eksprese retinal bipolar hücreler. Tedaviden önce bireysel zebra balıklarında bir zaman serisi konfokal görüntü alındı. Sarı ile gösterilen kontrollü bipolar hücrelerde membran etiketli YFP raportörünün mozaik ekspresyonu ve kırmızı ile gösterilen hedeflenen bipolarlarda nitro redüktaz kiraz füzyon proteini vardır.

Camgöbeği ile gösterilen zar etiketli CFP transgeni, daha fazla netlik için diğer retina hücrelerinin çoğu hakkında bağlamsal bilgi sağlar. Metronidazol ile tedaviyi takiben CFP sinyali olmayan aynı görüntü gösterilir. Bipolar hücreleri eksprese eden kırmızı nitro redüktaz kaybolurken, sarı kontrollü bipolar hücreler korunur.

Bu, bu ablasyon metodolojisinin oldukça spesifik doğasını göstermektedir. Yine, netlik için CFP'siz aynı görüntü gösterilir. Metro NIAZ çıkarıldığında, NTR eksprese eden hücreler buraya geri döner.

G-F-P-Y-F-P çıkarma yönteminin bir örneği bu şekilde gösterilmiştir: GFP, Mueller etiketli. GL hücreleri yeşil renkle gösterilir ve YFP etiketli bipolar hücreler mor renkle gösterilir. İkisi arasındaki örtüşme, çıkarma işlemini gerçekleştirmek için beyaz üretir.

Önce GFP ve YFP görüntüleri hizalanmalıdır. Çıkarma işlemi daha sonra YFP etiketli bipolar hücrelerin GFP görüntüsünden çıkarılmasına izin vererek, GFP etiketli Mueller ggl'nin temiz bir şekilde temsil edilmesine ve daha kısık Mueller hücrelerinin tespit edilmesine izin verir. Kırmızı ile gösterilen dim Mueller, ggl ve M kiraz etiketli bipolar hücreler arasındaki örtüşme artık doğrulanabilir.

Burada gösterilen veriler, bipolar hücre ablasyonunun kayıp hücrelerin yerini almak için mullar ggl'yi tetiklediğini göstermektedir. Bu yorum, Mueller Ggl'yi hem memelilerde hem de balıklarda yaralanmaya bağlı progenitörler olarak gösteren son retina rejenerasyonu çalışmaları ile uyumludur. Bu teknik, araştırmacıların zebra balıklarında kök hücrelerin görselleştirilmesi yoluyla belirli hücre tiplerinin yenilenmesini düzenleyen mekanizmaları keşfetmelerine olanak tanır.