Name: Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Öğrenin, çok renkli konfokal görüntüleme ve hedefli hücre ablasyonu yöntemleriyle Danio rerio'da nöral devre fonksiyonunu ve hücre özgülü nöronal rejenerasyonu nasıl çalışılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr teşekkür etmek istiyorum. Meera Saxena ve yazının yararlı yorumlar için Jonathan Mathias. Biz Dr teşekkür ederim. Transgenik hatları sağlayan Michael Parsons, Pamela Raymond, ve Rachel Wong. Protokolü 07-12-003 onaylı MCG IACUC tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı * B. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, R21 MH083614 ve Dimes Basil O Conner Başlangıç ​​Scholar Ödülü Mart tarafından desteklenen JSM

<ol><li>Köster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+microscopy+of+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse microscopy of brain development.</a> Methods Cell Biol. 76, 207-235 (2004).</li>
<li>Mumm, J. S., Williams, P. R., Godinho, L., Koerber, A., Pittman, A. J., Roeser, T., Chien, C. B., Baier, H., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+dendritic+targeting+of+laminated+afferents+by+zebrafish+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells.</a> Neuron. 52, 609-621 (2006).</li>
<li>Curado, S., Anderson, R. M., Jungblut, B., Mumm, J., Schroeter, E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236, 1025-1035 (2007).</li>
<li>Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+visual+responses+of+wild-type+and+hypopigmented+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish.</a> Vision Res. 42, 293-299 (2002).</li>
<li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+Coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. Coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+motility+and+actin+cytoskeleton+of+individual+neurons+and+neural+crest+cells+in%0A++zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in
 zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by%0A++confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by
 confocal microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

JSM zebrafish hücre ablasyon nitroreductase tabanlı bir sistem (Mumm JS ve Schroeter, Zebra balığı &quot;ABD Patent 7.514.595 EH Hedefli ve Bölgesel Ablasyon Hücresel Ablasyon. 7 Nisan 2009) kullanımına ilişkin bir patent verilmiştir. Bu teknik araçları ve JSM kurulmuş ve biyoteknoloji şirketi, Luminomics, Inc için genel bir platform olarak kullanılan in bir paydaş kalır

Bu video, çok renkli konfokal zaman atlamalı görüntüleme ve hedeflenen hücre ablasyon kullanım teknikleri hakkında genel bir bakış sağlanır. Hedeflenen hücre ablasyon nöral devre fonksiyonu ve hücre-spesifik nöronal rejenerasyon paradigmalar çalışmada kullanılan iken, in vivo ilgi birden fazla hücre tiplerinin davranışlarını izlemek için zaman atlamalı görüntüleme istihdam. Örnekler, bu yaklaşımların toplanan çeşitli avantajları vurgulamak gösterilir. Belki de en önemlisi, zaman atlamalı görüntüleme dahili kontrollü bir paradigma sağlar; gözlenen herhangi bir ve tüm fenomenlerin önceki durumlarına geri ilgili olabilir. Bu doğrudan yerine daha anlaşılmaktadır karşılaştırmalar ölçmek kolay göreceli değişiklikler yapma ve bir nüfus içinde yapılacak değişiklikler ile ilgili deneysel &#39;gürültü&#39; azaltarak, deneysel zaman noktaları arasında yapılacaktır sağlar. Çok renkli görüntüleme bir avantajı, etkileşim ve / veya komşu hücre tipleri değişiklik görselleştirmek için yeteneğidir. Örneğin, transgenik satırını kullanarak Müller glia etiketler, biz şimdi bu potansiyel yaralanma kaynaklı kök hücrelerin kaybı ayrık retinal hücre alt yanıt karakterize edilir. Ayrıca, yeni mekanizmalar nöral devre oluşumu 2 tanımlamak için bu yaklaşım kullandık . Son olarak, hücresel yenilenme çalışmalarının yanı sıra, son zamanlarda, nöronal alt tiplerinin fonksiyonel rolü, böylece çeşitli davranış paradigmalar ve elektrofizyolojik testlerin kullanarak ayrık nöral devrelerin araştırmak için NTR tabanlı ablasyon sistemi kullanılarak başladı. Rejeneratif kapasitesi nedeniyle uyarılan açıkları, geçici olarak, bu tür çalışmalar için zebrafish istihdam benzersiz bir avantaj. Böylece, zaman atlamalı görüntüleme testleri ile ilişkilendirilerek reinnervation yol mekanizmaların yanı sıra, fonksiyonel iyileşme için gerekli reinnervation ölçüde typify. Birçok farklı sorulara verilen yöntemler adapte edilebilir. Örneğin, ablasyon ve yenilenme benzer analizler transgenically tanımlanabilir herhangi bir hücresel alt tipine uygulanabilir. Toplu olarak bu tür çalışmalar, tek tek hücre tipleri düzeyinde ve ayrık kök hücre nişler içinde rejenerasyon anlayışımızı genişletmek için potansiyel var.

1. Reaktifler: Danieau Kullanıcı çözüm: <ul><li> sodyum klorür (Fisher, S271 1) </li><li> potasyum klorür (Fisher, P217 500) </li><li> Hepes (Fisher, BP310500) </li><li> magnezyum sülfat (Fisher, 500 M65) </li><li> kalsiyum nitrat (Fisher, C109500) </li><li> Penisilin-Streptomisin (Fisher ICN1670049) </li></ul> Diğer reaktifler: <ul><li> Düşük erime agaroz (Fisher, BP165-25) </li><li> Tricane methanesulfonate (Fisher NC9435281) </li><li> N-phenylthiourea (Fisher NC9968868) </li><li> Metronidazol (Fisher, AC21034-1000) </li></ul> 2. Malzemeleri: <ul><li> Derin Petri yemekleri (Fisher Scientific / Corning, 08-772-32) </li><li> Dumont # 5 ince forseps (Fisher, NC9404145) </li></ul> 3. Ekipman: <ul><li> Zoom Stereoskop (Olympus, SZ51) </li><li> Floresans zoom Stereoskop (Olympus, SZX16) </li><li> Konfokal mikroskobu (Olympus FV1000) </li><li> Dijital blok ısıtıcı - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) </li><li> Barnstead / Thermolyne Masaüstü İnkübatör (Fisher, 11-702-4). </li></ul>

transgenik zebra balığı multicolor time-lapse görüntüleme: hedefli nöronal hücre ablasyon aktifleşir görselleştirme retina kök hücreler

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

Yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı canlı zebrafish larva görüntüleme biyolojik süreçlerin nasıl (inceleme için bkz 1) açılmak görselleştirmek için kullanılabilir. Komşu hücre tipleri farklı floresan gazetecilere ifade Bileşik transgenik balık, zamanla deneysel manipülasyonlar hücresel etkileşimleri 2 ve / veya doku düzeyinde yanıtları aşağıdaki bir araç sağlar . Bu video, birkaç gün dakika yayılabilir zamanlı kurslar üzerinden bireysel balık seri görüntüleme birden fazla transgenically etiketli hücre türleri için kullanılabilir yöntemler göstermektedir. Ayırmak için basitleştirilmiş) yaklaşımlar 1) seri yakalama ve bırakma &#39;görüntüleme yöntemleri, 2 ardışık gün boyunca çok sayıda balık, açıklanan teknikler de dahil olmak üzere, zamanla komşu hücre türleri &quot;davranış&quot; korelasyon isteyen herhangi bir çalışma uygulanabilir: uyarma / emisyon üst üste profiller (örneğin, GFP ve YFP), 3), geliştirme, 4 geç larva etap halinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme için zaman penceresi genişletmek için hipopigmente mutant hatların kullanımı) floresan gazetecilere ortaya hedeflenen membran kullanımı ile fluorophores tek tek hücrelerin yanı sıra hücrelerin büyük popülasyonlarda hücresel bilgi, 5) ve transgenically hedeflenen hücre tipleri kimyasal kaynaklı ablasyon için daha önce açıklanan bir yöntem ince morfolojik detay gibi metronidazol gibi yani, nitroreductase (NTR) prodrogu yüzeylerin aracılı dönüşüm, (MTZ), sitotoksik türevleri 3,5. Bu yaklaşımların bir örnek olarak, retina bipolar nöron, birkaç gün içinde bireysel balık içinde bir alt ablasyon ve yenilenme görselleştirmek. Aynı zamanda komşu hedefli olmayan bipolar hücreleri ve dejenerasyon ile uyarılmış potansiyel retina kök hücreleri (yani, Mϋller glia) dahil olmak üzere birçok diğer retinal hücre tipleri, izleyecek. Bu strateji, hedef nöronal hücre tipleri seçici kaybına ve yenilenme için hücre ve doku düzeyinde (örneğin, kök hücre niş) yanıtları karakterize etmek için laboratuarda uygulanmaktadır.

Bu video, çok renkli konfokal zaman atlamalı görüntüleme ve hedeflenen hücre ablasyon teknikleri verilmektedir. Time-lapse görüntüleme ilgi birden fazla hücre tiplerinin davranışlarını izlemek için kullanılır<em&gt; In vivo</em&gt;. Hedeflenen hücre ablasyon çalışmada nöral devre fonksiyonu ve hücre spesifik nöronal rejenerasyon paradigmalar kolaylaştırır.

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

Canlı zebra balığı larvalarının yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntülemesi, biyolojik süreçlerin nasıl geliştiğini görselleştirmek için kullanılabilir (inceleme için bkz. 1). Bileşik ...

Transgenik hayvanlarda floresan raporlayıcıların ekspresyonu, canlı hastalık modellerinde deneysel manipülasyonlara verilen hücresel yanıtların izlenmesini mümkün kılar. Burada, zebra balıklarında seçici hücre kaybı farmakolojik olarak indüklenmiş; hedeflenen hücrelerin ve yakın komşularının yüksek çözünürlüklü çok renkli konfokal görüntüleri ilaç uygulamasından hemen önce, hemen sonra ve takip eden belirli aralıklarla elde edilmiştir. Görüntü analizi, iyileşme evresi boyunca endojen kök hücre popülasyonlarının aktivasyonunu ve ardından hedeflenen hücrelerin yerine konulduğunu göstermektedir.Bu yöntem, rejeneratif biyoloji alanındaki "ayrı hücre tiplerini rejenerasyon için kullanılan hücresel ve moleküler mekanizmalar nelerdir" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Döllenmeden sonraki 16. saatte, çiftleşmelerden toplanan transgenik yumurtaları 0.3 x danio çözeltisi içeren bir Petri kabına aktararak başlayın. Hedef dokuda herhangi bir pigmentasyon belirtisi görülmeden önce tirozinaz aktivitesini inhibe etmek için PTU ekleyin. Embriyo albino değilse, embriyoları 28.5 °C'de inkübe edin.Raporlayıcılar belirgin hale geldiğinde, Petri kabını floresan stereo zoom mikroskobunun altına yerleştirin ve istenen transgen ekspresyonuna göre ayıklama yapın. Görüntüleme öncesinde, embriyo ortamında %0,5 düşük erime noktalı aeros montaj çözeltisi hazırlayın ve bunu 40 °C'de saklayın.Gerekirse trica ve PTU ekleyin. Nazikçe karıştırın ve tekrar 40 °C'ye getirin. Balıkları, trica içeren embriyo ortamına yerleştirerek anestezi altına alın.Balıklar yaklaşık üç dakika boyunca tepkisiz hale gelecektir. Mikropipet kullanarak dokunmak için, münferit balıkları yaklaşık 30 µL anestezik çözelti hacmindeki budanmış bir pipet ucuna çekin. Ardından, pipeti ters çevirin ve balığın dibe çökmesini sağlayın.Ucu montaj solüsyonuna dokundurun ve yerleşimin yerçekimi ile gerçekleşmesini sağlayın. Tekrar kullanılabilmesi için agarın seyreltilmemesine dikkat edin. Mikropipette kalan anestezik solüsyonu atın.Ardından aynı uçla balığı bir Petri kabına aktarın. Yaklaşık 30 µL mount çözeltisi içerisinde, ilgi alanı aeros damlacığının merkezine gelecek şekilde balığı nazikçe konumlandırın. Aeros katılaşana kadar balığın istenen konumda kaldığından emin olun.İstenirse, tek bir Petri kabına birden fazla balık yerleştirilebilir. Aeros katılaştıktan sonra balıkları konfokal mikroskop tablasına taşıyın ve balıklar tamamen suya gömülene kadar kaba PTU içeren veya içermeyen trica içeren embriyo medyumu yavaşça ekleyin. Görüntüleme yazılımını açın ve hücresel ve/veya moleküler detayların optimal görüntülemesi için ilgilenilen bölgeye odaklanın.Yazılımda, yüksek sayısal açıklığa sahip uzun çalışma mesafeli objektifler kullanın. Çevirme listesinden uygun flora kanallarını seçin. Spektral ayarlar kısmına tıklayın ve emisyon aralıklarında düzenlemeler yapın.Raporlayıcı sinyallerin temiz bir şekilde ayrılmasını sağlamak ve sinyal-gürültü oranlarını maksimize etmek için, yazılım tarafından tanımlanan ön ayarların doğru şekilde düzenlendiğinden emin olmak adına açılır menüden uygun objektifi seçin. Lazerleri odaklamak ve güç seviyelerini ayarlamak için, her kanal için piksel doygunluğunu gösteren bir çıkışı arama tablosundan seçin.Ardından, istenen görüntü kalitesini elde etmek için dedektör hassasiyetini ayarlayın ve görüntü yoğunluğu kabul edilebilir düzeye gelene kadar lazer çıkışını kademeli olarak artırın. İlgi bölgesinde piksel doygunluğundan kaçının ve fotobleyklendirme ile fototoksisite sorunlarını azaltmak için lazer seviyelerini mümkün olduğunca düşük tutun.Tüm görüntüleme kanallarını izlerken lazerleri manuel olarak açıp kapatarak, her bir lazer hattının yalnızca uygun kanalda tespit edilebilir sinyal ürettiğinden emin olun. Herhangi bir çapraz etkileşim (crosstalk) görülmüyorsa, tüm kanallar eş zamanlı olarak elde edilebilir. Ardından, zoom ve döndürme fonksiyonlarını kullanarak ilgilenilen alanı çerçeveleyin.Ardından, daha hızlı tarama hızları kullanarak lazer bekleme süresini minimize eden ve zamansal çözünürlüğü artıran tarama hızını ve görüntü boyutunu ayarlayın. Z boyutu adım boyutunu deneysel ihtiyaçlara göre belirleyin. Burada, retinal dokunun yedi optik kesitini görüntülemek için 10 mikronluk bir adım boyutu kullanılmıştır.Uygun ayarlar belirlendikten sonra Zack görüntülerini edinin ve kaydedin. Ardından bir sonraki balığa geçin. Hücresel değişimleri ardışık günler boyunca izlemek için, beraberindeki yazılı belgede yer alan talimatlara göre seri yakala-bırak görüntüleme işlemi gerçekleştirilebilir.Çoklu raporlayıcı görüntüleme deneyi gerçekleştirilirken, spektral olarak iyi ayrışmış floresanların kullanılması en iyisidir; ancak bu her zaman pratik olmayabilir. Burada, örtüşen eksitasyon ve emisyon profillerine sahip floresanları ayırmak için açık kaynaklı ImageJ yazılımını kullanan basit bir görüntü çıkarma yöntemini gösteriyoruz. Bizim örneğimizde bunlar GFP ve YFP'dir.Bu videoda açıklanan zaman ayarlı görüntüleme teknikleri, retinal bipolar nöronların ablasyonu ve rejenerasyonu sırasında GFP etiketli retinal kök hücreleri izlemek için kullanılmıştır. Spektral ayırımı gerçekleştirmek için, örtüşen floresanların sırasıyla bağımsız olarak elde edilmesini ve kısmen ayrıştırılmasını sağlayan ardışık görüntüleme modlarını ve değişken bariyer filtre ayarlarını kullanarak görüntüler toplayın. Görüntüler elde edildikten sonra, görüntü dosyalarını açmak için ImageJ loci bio formas import aracını kullanın ve içe aktarma aracını başlatın. İlgili dosyayı ImageJ penceresine sürükleyin.Align three TP eklentisini başlatmak için içe aktarma penceresindeki kanalları ayır (split channels) onay kutusunu kullanarak kanalları ayrı yığınlara bölün. Eklentiler (plugins) sekmesine, ardından yığınları hizala (align stacks) seçeneğine tıklayın. Sonrasında align three tp seçeneğini seçin.Doğru çıkarma işleminin sağlanması için yığınlar hizalanmalıdır. İlk açılır kutudan referans yığını, ikincisinden ise hizalanmamış yığını seçin. "use XY relative origin" ve "use Z relative origin" kutucuklarını işaretleyin ve tamam'a tıklayın.Hizalama işlemini başlatmak için hacim kaydı butonuna tıklayın. Hizalama parametrelerini içeren yeni bir pencere açılacaktır. Tamam'a tıklayın.Bu bölüm, eklentinin dağıtıcısı tarafından optimize edildiğinden herhangi bir modifikasyona gerek yoktur. İşlem tamamlandığında, hizalanmış yığınlar penceresi görünecektir. Çıktı penceresini açmak için hizalanmış pencereden çıktıyı seçin.Bu pencere de optimize edilmiştir ve herhangi bir değişikliğe ihtiyaç duymaz. Tamam'a tıklayın. Çalışma alanında, dosya başlığının sonuna "aligned" ifadesi eklenmiş yeni bir yığın görünecektir.Görüntü hesaplayıcıyı kullanarak çapraz etkileşimi gidermek için, işlem menüsüne ardından görüntü hesaplayıcıya tıklayın. Birinci görüntü açılır kutusundan çıkarılacak yığını ve çıkarma işleminde kullanılacak yığını seçin. İkinci görüntü açılır kutusunda, işlem açılır kutusundan çıkarma seçeneğini seçin ve tamam'a tıklayın.Image J, yığının (stack) işlenmesini isteyecektir. Evet seçeneğini belirleyin. Üst üste binen kanallar arasındaki çapraz etkileşimin (crosstalk) giderildiği yeni bir yığın görünmelidir.Hizalama ve çıkarma işlemlerinden önceki aynı görüntü yapısını yeniden oluşturmak için yığınları birleştirin. Kanal araçları penceresinde birleştirilmiş kanallar seçilerek, araç yardımıyla dört yığına kadar hiper yığın (hyper stack) halinde birleştirilebilir. Son olarak, kanalları renklendirin, parlaklık ve kontrast ayarlarını yapın ve nitro redüktazın hedeflenen kaybını ve rejenerasyonunu incelemek için dosyaları tiff olarak kaydedin.M cherry ekspresyonu yapan retinal bipolar hücreler. Tedavi öncesinde tekil zebrafish'lerde konfokal görüntülerden oluşan bir zaman serisi alınmıştır. Kontrollü bipolar hücrelerde membran etiketli YFP raporerinin sarı renkte, hedeflenen bipolar hücrelerde ise nitro redüktaz cherry füzyon proteininin kırmızı renkte mozaik ekspresyonu görülmektedir.Siyan renkte gösterilen membran etiketli CFP transgeni, daha fazla netlik sağlamak amacıyla diğer çoğu retinal hücre hakkında bağlamsal bilgi sunmaktadır. CFP sinyali olmayan aynı görüntü, metronidazol uygulaması sonrası gösterilmiştir. Kırmızı renkli nitroredüktaz eksprese eden bipolar hücreler kaybolurken, sarı renkli kontrol bipolar hücreleri korunmuştur.Bu, söz konusu ablasyon metodolojisinin oldukça spesifik doğasını göstermektedir. Netlik sağlamak amacıyla, aynı görüntü tekrar CFP olmadan gösterilmiştir. metro NIAZ uzaklaştırıldığında, NTR eksprese eden hücreler burada yeniden görülür.G-F-P-Y-F-P çıkarma yöntemine bir örnek, bu şekildeki GFP etiketli Mueller GL hücreleri ile gösterilmiştir. GL hücreleri yeşil, YFP etiketli bipolar hücreler ise mor renkte gösterilmiştir. Çıkarma işleminin gerçekleştirilmesi için iki rengin örtüşmesi sonucunda beyaz renk oluşur.Önce GFP ve YFP görüntüleri hizalanmalıdır. Ardından çıkarma işlemi, YFP ile işaretlenmiş bipolar hücrelerin GFP görüntüsünden çıkarılmasını sağlayarak, GFP ile işaretlenmiş Mueller glia hücrelerinin net bir şekilde temsil edilmesine ve daha sönük Mueller hücrelerinin tespit edilmesine olanak tanır. Sönük Mueller glia hücreleri ile kırmızıyla gösterilen M cherry ile işaretlenmiş bipolar hücreler arasındaki örtüşme artık doğrulanabilir.Burada gösterilen veriler, bipolar hücre ablasyonunun kaybolan hücrelerin yerini doldurması için müller glia hücrelerini tetiklediğini göstermektedir. Bu yorum, hem memelilerde hem de balıklarda Müller glia hücrelerini yaralanma kaynaklı progenitörler olarak tanımlayan güncel retina rejenerasyonu çalışmalarıyla uyumludur. Bu teknik, araştırmacıların zebra balıklarındaki kök hücreleri görselleştirerek belirli hücre tiplerinin rejenerasyonunu düzenleyen mekanizmaları incelemesine olanak tanır.

multicolor-time-lapse-imaging-transgenic-zebrafish-visualizing

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, uzun vadeli görüntüleme, iki foton görüntüleme ve doku hasarı teknikleri ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme zebrafish embriyolar montaj için bir yöntem açıklanmaktadır.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Mevcut video, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bireysel nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme gerçekleştirmek için elektroporasyon ve konfokal mikroskopi kombinasyonu yararlanır bir yöntem gösteriyor.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Source: Muto, A., et al. İki Fotonlu Lazer Kullanılarak Bir Nöronal Popülasyonun Ablasyonu ve Zebra Balığı Larvalarında Kalsiyum Görüntüleme ve Davranışsal Kayıt Kullanılarak Değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018)p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'&gt;Bu videoda, agarozla hareketsiz hale getirilmiş zebra balığı larvalarında floresan nöronların seçici olarak yok edilmesini sağlayan iki fotonlu bir lazer ablasyon prosedürü gösterilmektedir. İşlemden önce ve sonra...

Bir Zebra Balığı LarAva'da İki Foton Mikroskobu Kullanılarak Hedeflenen Nöronal Ablasyon

Kaynak: Lahne, M., et.al. Multifoton Mikroskobu ile Canlı Hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra Balığı Retinal Eksplantlarının Kültürü. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, ışık kaynaklı fotoreseptör hasarını takiben agaroza gömülü zebra balığı retinal eksplantlarında Muller glial nükleer göçünün canlı hücre görüntülemesini göstermektedir. Hasarlı fotoreseptörler tarafından salınan tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α), Muller glial hücrelerini aktive ederek mitoz ve nöronal progenitör oluşumu...

Zebra Balığı Retina Rejenerasyonu Sırasında Müller Glial Nükleer Migrasyonunun Canlı Hücre Görüntülemesi

Kaynak: Williams, A. L.,  et al. Gelişimi Gerçek Zamanlı Olarak Görselleştirmek için Çoklu Foton Hızlandırılmış Görüntüleme: Zebra Balığı Embriyolarında Göç Eden Nöral Krest Hücrelerinin Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, bir zebra balığı embriyosundaki nöral krest hücrelerinin göçünü gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlükte görselleştirmek için çok fotonlu hızlandırılmış bir görüntüleme protokolünü göstermektedir.

Çoklu Foton Zaman Atlamalı Görüntüleme Kullanarak Bir Zebra Balığı Embriyosunda Nöral Krest Hücre Göçünü Görselleştirme

Periferal sinir sisteminin (PNS) yaralanmadan sonra önemli tamir yeteneğine sahip olmasına rağmen, küçük bu olgu yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları bilinmektedir. Canlı, transgenik zebrafish ve tekrarlanabilir bir sinir kesisi testi kullanarak, sinir dejenerasyonu ve rejenerasyonu sırasında dinamik glial hücre davranışlarını eğitim görebilirsiniz.

Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

Zebra balığı retina rejenerasyon çoğunlukla sabit retina kullanılarak incelenmiştir. Ancak, bu tür interkinetic nükleer göç gibi dinamik süreçler rejeneratif tepki sırasında meydana gelen ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada, biz multiphoton mikroskopi kullanılarak Interkinetic Nükleer Göç (INM) gerçek zamanlı olarak izlemek için kültür ve görüntüleme koşulları açıklar.

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

farklı genetik kökenden bireysel WT retina atalarıdır Canlı izleme nöron sırasında hücre özerk olmayan sinyalizasyon katkısı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, embriyo transplantasyonu yoluyla ve in vivo time-lapse konfokal görüntüleme gen demonte, kimera nesil bir arada bu amaçla kullanılmıştır.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

Lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP) Zebra balığı embriyo nöral crest göçün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görüntüleme yakalamak için uygulanmıştır.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

In vivo görüntüleme sinir sistemi gelişiminin altında yatan hücresel mekanizmaları araştırmak için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. Burada, gelişmekte olan zebra balığı sinir sistemi içinde çok renkli Brainbow etiketli çok sayıda hücreyi gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için zaman atlamalı konfokal mikroskopiyi kullanma tekniğini açıklıyoruz.

Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme

Burada zebra balığı embriyonik beynini larva ve çocuk evrelerine kadar in vivo olarak görüntüleyen bir yöntem sunuyoruz. Elektrofizyolojik yaklaşımlardan uyarlanan bu mikroinvaziv prosedür, olgun nöronun hücresel ve hücre altı ayrıntılarına erişim sağlar ve beyin fonksiyonu ve ilaç müdahalesini karakterize etmek için optogenetik ve nörofarmakolojik çalışmalarla birleştirilebilir.

Kafatası ve Deri Temizleme ile Uyanık Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Tam Aktif Beyin Dokusunun In vivo Görüntülemesi

Öğrenin, çok renkli konfokal görüntüleme ve hedefli hücre ablasyonu yöntemleriyle Danio rerio'da nöral devre fonksiyonunu ve hücre özgülü nöronal rejenerasyonu nasıl çalışılır.

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler (Video) | JoVE Journal

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

Daha fazla video keşfet