Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, SI RNA Transfeksiyonu ile DCS'deki hedef gen ekspresyonunu yıkmaktır. Bu, önce Maxin Nucleo efektörünün programlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, DCS ve siRNA'yı birlikte karıştırmak ve elde edilen hücre çözeltisini Nucleo QVE modüllerine pipetlemektir.

Prosedürün üçüncü adımı, transfeksiyon işlemine başlamak için plakayı amaxa mekik tepsisine yerleştirmektir. Prosedürün son adımı, interferon yanıtını aktive etmek için hücreleri virüsle enfekte etmektir. Sonuç olarak, kantitatif R-T-P-C-R ve Western blotlama yoluyla gen yıkımını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu teknik, dendretik hücrelerdeki sinyal yolaklarını karakterize etmek için değerlidir ve dendretik hücre bazlı immün tedavilerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir. Maxon 96 kuyu mekiği nükleo faktörünü DC transfeksiyonu için programlamak için yeni bir parametre dosyası açın. İmleci 96 kuyulu plaka diyagramının üzerine sürükleyerek standart transfeksiyon için kullanacağınız kuyu sayısını seçin.

Her deneysel numune için havuzlamak üzere en az üç kuyu kullanın. Şimdi program kodunu girin, birinci bölümde F, F ve i ikinci bölümde seçin, açılır menülerden 1 68'i seçin. Ardından çözüm kutusundan, kontrol seçeneği altında monosit insan'ı seçin, ardından standart'ı seçin ve ardından uygula'ya tıklayın.

Transfeksiyon kontrolü içermeyen bir kontrol eklemek için, diyagramdan ek kuyucuklar seçmek gerekir. Ardından kontrol seçeneğinden program kontrolü yok'u seçin ve tekrar uygula'ya tıklayın. Nükleo sevgi solüsyonunu karıştırdıktan sonra oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.

İhtiyaç duyulan sayıda nucleo vete modülünü, ilkini gül bir ve iki içine yerleştirerek ve ardından sonraki tüm tüpler için bu şekilde devam ettirerek burada gösterildiği gibi doğru yönde nucleo VETE plakasına yerleştirin. Transfeksiyon için kuyu başına 500.000 hücreye sahip olmak için bir hücre kültürü şişesinden yeterli DCS'yi 50 mililitrelik bir tüpe aktarın, hücreleri dört santigrat derecede 400 G'de 10 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı dikkatlice çıkarın. Ardından, tüpe nükleer sevgi çözeltisi ekleyin ve ardından birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek DCS'yi yeniden süspanse edin.

Şimdi DPH tüplerini yapılacak spesifik tedaviye göre etiketleyin ve ardından yeniden süspanse edilmiş hücreleri etiketli tüplere bölün. Uygun epi endorf tüplerine 500.000 hücre başına 0.25 mikrogramlık bir nihai konsantrasyonda SI RNA ekleyin ve ardından hücre süspansiyonlarını pipetleme ile karıştırın. Transfeksiyon kontrol örneği için hedef olmayan SI RNA kullanın.

Ardından, 20 mikrolitre SI RA DC hücre süspansiyonunu önceden programlanmış deney düzenine göre nükleo vete modüllerine pipetleyin, sıvının kuyunun dibine verildiğinden emin olun, nükleo vete plakasını bir kapakla kapatın ve dcs'yi kesmek için hava kabarcıklarının çıkarılmasını kolaylaştırmak için plakayı sert bir yüzeye birkaç kez vurun. Hazırlanan nucleo Yvette plakasını nucleo effector 96 kuyulu mekik tepsisine yerleştirin. Ardından yükle ve başlat düğmesini tıklayın.

Ekrandaki transfeksiyon işleminin ilerlemesini takip edin. Yeşil bir arka plan üzerindeki siyah bir çarpı, o kuyuda başarılı bir transfeksiyon olduğunu gösterirken, kırmızı bir arka plan üzerindeki siyah bir çubuk, hücreler transfekte edilirken başarısız olduğu anlamına gelir. DC büyüme ortamını önceden ısıtın Transfeksiyon işleminin tamamlanmasının ardından, plakayı çıkarın ve her bir oyuğa 80 mikrolitre ön ısıtma DC büyüme ortamı ekleyin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, plakayı şimdi 37 santigrat derecede ve %5 CO2'de 10 dakika inkübe edin. Kuluçka süresi boyunca, 100 mikrolitre ön ısıtma DC büyüme ortamını, çekirdek küvet plakası kurulumuyla aynı yönde matris tüplerine ekleyin. Kuluçka süresinden sonra, hücre süspansiyonlarının 100 mikrolitresinin tamamını çekirdek CVE'lerden önceden düzenlenmiş matris tüplerine aktarın.

Daha sonra transfeksiyonun meydana gelmediği tüpleri çıkarın ve atın. Son olarak, matris tüplerini 24 saat veya istenen başka bir zaman aralığında inkübe edin. İnkübasyon matris tüplerinin her biri için einor tüplerini etiketleyin.

Daha sonra matris tüplerini inkübatörden bir hücre kültürü başlığına aktarın ve her deneysel numune için matris tüplerini önceden etiketlenmiş eend dfs'ye toplayın. Ardından, eend DPH tüplerini bir masaüstü santrifüjde 10 dakika döndürerek hücreleri nazikçe peletleyin. 400 G'de, snat'ı çıkarın, Newcastle hastalığı virüsü veya NDV içeren serum serbest büyüme ortamındaki hücreleri gevşek bir şekilde bir MOI'de yeniden süspanse edin.

Epi endorfinleri steril bir şekilde örtün ve ardından tüpleri 45 dakika inkübe edin. Bu inkübasyon süresinden sonra, 900 mikrolitre DC büyüme ortamı ekleyin ve tüpleri sekiz ila 10 saat daha inkübe edin. Transfekte edilmiş ve enfekte olmuş dcs'yi hasat etmek için.

Daha önce olduğu gibi einor tüplerini bir masaüstü santrifüjde döndürerek hücreleri peletleyin ve snat monositini çıkarın, DC'ler ya RIG I'i hedefleyen IRNA ya da spesifik olmayan kızdırma irna ile transfekte edildi ve artı işareti ile gösterildiği gibi NDV ile enfekte oldu veya eksi işareti ile gösterildiği gibi enfekte olmadı, kantitatif R-T-P-R-R-A ile tespit edildiği gibi% 75 oranında Transkripsiyon seviyesinde, ekspresyonunda benzer bir azalma gözlendi. İnterferon beta. İnterferon sinyal kaskadında RGA'nın bir aşağı akış efektörü de gözlendi. Ayrıca, enfekte olmayan kontrol transfekte edilmiş hücrelerde interferon beta ekspresyonu tespit edilememiştir.

MXA ve interferon beta aşağı akış yanıt genininki ise minimaldi. Burada. Önceki şekilde olduğu gibi gerçekleştirilen rigi hedefleme irna ile DCS'nin ikinci bir transfeksiyonundan elde edilen veriler bu deneyde gösterilmiştir. Bununla birlikte, tüm hücreler NDV ile enfekte edildi ve rezeke edilmemiş Monosit DCS kullanılarak ek bir kontrol dahil edildi.

Gen susturma sonuçları, önceki şekilde gözlemlenenlere benzerdi. RGA için incelenen bir western lekesi, bu genin protein ekspresyonunun tamamen bloke edildiğini ortaya çıkardı. Birinci ve ikinci şeritler, rezeke edilmemiş hücrelerden gelen lizatlar için verileri gösterir.

Üçüncü ve dördüncü şeritler, kızdırma irna transfekte edilmiş hücrelerden lizatları gösterir ve beşinci ve altıncı şeritler, S Irna'yı hedefleyen RIG I ile transfekte edilmiş hücrelerden lizatları gösterir Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, birçok genin aynı anda yıkılması da dahil olmak üzere bir saat içinde yapılabilir.