Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, SI RNA Transfeksiyonu ile DCS'de hedef gen ekspresyonunu baskılamaktır. Bu işlem, önce AM Maxin Nucleo efektörünün programlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, DCS ve siRNA'yı birlikte karıştırmak ve elde edilen hücre solüsyonunu Nucleo QVE modüllerine pipetle aktarmaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, transfeksiyon işlemini başlatmak için plakayı amaxa mekiği tepsisine yerleştirmektir. Prosedürün son adımı, interferon yanıtını aktive etmek için hücreleri virüsle enfekte etmektir. Sonuç olarak, kantitatif R-T-P-C-R ve Western blotting yoluyla gen nakavtunu (knockdown) gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu teknik, dendritik hücrelerdeki sinyal yolaklarının karakterizasyonu için değerlidir ve dendritik hücre tabanlı immünoterapilerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir. DC transfeksiyonu için Maxon 96 kuyucuklu taşıyıcı nükleo faktörünü programlamak için yeni bir parametre dosyası açın. İmleci 96 kuyucuklu plaka diyagramı üzerinde sürükleyerek standart transfeksiyon için kullanacağınız kuyucuk sayısını seçin.

Her bir deneysel örnek için havuzlama yapmak üzere en az üç kuyucuk kullanın. Şimdi birinci bölümdeki program kodunu girin ve F'yi seçin, ikinci bölümde ise açılır menülerden 1 68'i seçin. Ardından çözüm kutusundan monocyte human seçeneğini, kontrol seçeneğinin altından ise standard seçeneğini işaretleyin ve ardından uygula butonuna tıklayın.

Transfeksiyon yapılmayan bir kontrol eklemek için, diyagramdan ek kuyucukların seçilmesi gerekir. Ardından kontrol seçeneğinden, program kontrolü yok seçeneğini belirleyin ve tekrar uygula düğmesine tıklayın. Nukleofeksiyon solüsyonunu karıştırdıktan sonra, oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.

Burada gösterildiği gibi, ilk modülü birinci sıraya, ardından diğerlerini sırasıyla takip eden tüplere yerleştirerek, gerekli sayıdaki nucleo vete modülünü doğru yönde nucleo VETE plakasına yerleştirin. Transfeksiyon için kuyu başına 500.000 hücre olacak şekilde, bir hücre kültür balonundan yeterli miktarda DCS'yi 50 mililitrelik bir tüpe aktarın; hücreleri 4 °C'de 400 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Daha sonra, tüpe nükleer efeksiyon solüsyonu ekleyin ve DCS'yi birkaç kez nazikçe pipetleyerek yeniden süspande edin.

Şimdi DPH tüplerini uygulanacak spesifik işleme göre etiketleyin ve ardından resüspande edilen hücreleri etiketli tüplere paylaştırın. Uygun epi endorf tüplerine, 500,000 hücre başına 0.25 µg son konsantrasyon olacak şekilde SI RNA ekleyin ve ardından hücre süspansiyonlarını pipetleme yoluyla karıştırın. Transfeksiyon yapılmayan kontrol örneği için hedef dışı SI RNA kullanın.

Ardından, önceden programlanmış deney düzenine göre 20 µL SI RA DC hücre süspansiyonunu nucleo vete modüllerine pipetleyin ve sıvının kuyucuğun tabanına ulaştığından emin olun; DC'leri transfekte etmek için hava kabarcıklarının uzaklaştırılmasını kolaylaştırmak amacıyla nucleo vete plakasını bir kapakla kapatın ve plakayı sert bir yüzeye birkaç kez hafifçe vurun. Hazırlanan nucleo Yvette plakasını nucleo effector 96 kuyucuklu taşıyıcı tepsiye yerleştirin. Daha sonra yükle ve başlat (upload and start) düğmesine tıklayın.

Transfeksiyon sürecinin ilerlemesini ekrandan takip edin. Yeşil arka plan üzerindeki siyah bir artı işareti, o kuyucukta transfeksiyonun başarılı olduğunu; kırmızı arka plan üzerindeki siyah bir çubuk ise hücreler transfekte edilirken işlemin başarısız olduğunu belirtir. Transfeksiyon süreci tamamlandığında DC büyüme ortamını önceden ısıtın, plakayı çıkarın ve her kuyucuğa 80 µL ön ısıtılmış DC büyüme ortamı ekleyin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak plakayı 10 dakika boyunca 37 °C ve %5CO2'de inkübe edin. İnkübasyon süresince, önceden ısıtılmış DC büyüme ortamından 100 µL'yi, nucleo küvet plakası düzeniyle aynı yönde olacak şekilde matriks tüplerine ekleyin. İnkübasyon süresi sona erdiğinde, hücre süspansiyonlarının tamamını (100 µL) nucleo CVE'lerden önceden hazırlanmış matriks tüplerine aktarın.

Ardından, transfeksiyonun gerçekleşmediği tüpleri çıkarın ve atın. Son olarak, matriks tüplerini 24 saat veya istenen diğer zaman aralığı boyunca inkübe edin. İnkübe edilen her bir matriks tüpü için einor tüplerini etiketleyin.

Ardından, matris tüplerini inkübatörden hücre kültür kabinine aktarın ve her bir deneysel örnek için matris tüplerini önceden etiketlenmiş eend dfs tüplerinde birleştirin. Sonra, eend DPH tüplerini bir masaüstü santrifüjde 10 dakika boyunca 400 G'de çevirerek hücreleri nazikçe çöktürün. Üst fazı uzaklaştırın ve hücreleri, 1 MOI değerinde Newcastle hastalığı virüsü veya NDV içeren serumsuz büyüme ortamında hafifçe süspanse edin.

Epi endorfinleri steril bir şekilde kapatın ve ardından tüpleri 45 dakika boyunca inkübe edin. Bu inkübasyon süresinin ardından, 900 µL DC büyüme ortamı ekleyin ve tüpleri sekiz ila 10 saat daha yeniden inkübe edin. Transfekte edilmiş ve enfekte edilmiş DC'leri hasat etmek için.

Einor tüplerini daha önce olduğu gibi masaüstü santrifüjde çevirerek hücreleri pelitleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Monosit türevli DC'ler, ya RIG-I'yi hedefleyen siRNA ile ya da spesifik olmayan glow siRNA ile transfekte edildi ve artı işaretiyle belirtildiği üzere NDV ile enfekte edildi veya eksi işaretiyle belirtildiği üzere enfekte edilmeden bırakıldı. Kantitatif R-T-P-C-R ile tespit edildiğinde, transkripsiyon düzeyinde RIG-I'nin %75 oranında susturulduğu gözlemlendi; interferon beta ekspresyonunda da benzer bir azalma görüldü. İnterferon sinyalizasyon kaskadında RIG-I'nin bir alt akış efektöründe de benzer bir durum gözlemlendi. Ayrıca, enfekte edilmemiş kontrol transfekte hücrelerde interferon beta ekspresyonu tespit edilemedi.

MXA ve interferon beta alt tepki geni için ise bu değer minimaldi. Burada, önceki şekilde yapıldığı gibi rigi hedefleyen irna ile DCS'nin ikinci bir transfeksiyonundan elde edilen veriler bu deneyde gösterilmiştir. Ancak, tüm hücreler NDV ile enfekte edilmiştir ve rezeke edilmemiş Monosit DCS kullanılarak ek bir kontrol eklenmiştir.

Gen susturma sonuçları, önceki şekilde gözlemlenenlerle benzerdi. RGA için yapılan western blot analizi, bu genin protein ekspresyonunun tamamen engellendiğini ortaya koydu. Birinci ve ikinci şeritler, rezeke edilmemiş hücrelerden elde edilen lizatlara ait verileri göstermektedir.

Üçüncü ve dördüncü şeritler glow irna transfekte edilmiş hücrelerden elde edilen lizatları, beşinci ve altıncı şeritler ise RIG I hedefli S Irna transfekte edilmiş hücrelerden elde edilen lizatları göstermektedir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, birçok genin aynı anda susturulması da dahil olmak üzere işlem bir saat içinde tamamlanabilir.