Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir In vivo
June 26th, 2013
Floresan boya retrograd taşıma anatomik projeksiyona dayalı nöronların bir alt-nüfus etiketler. Etiketli akson görsel olarak hedeflenebilir In vivo, Belirlenen aksonlardan ekstraselüler bir kayıt izin verir. Bu teknik nöronlar genetik manipülasyon yoluyla etiketli ya da izole etmek zor olamaz zaman 'kör' kullanarak kayıt kolaylaştırır In vivo Yaklaşımlar.
Bu prosedürün genel amacı, genetik olmayan bir model sistemde tanımlanmış bir nöron popülasyonundan in vivo olarak tek birim yanıtlarını kaydetmektir. Bu, önce ilgilenilen beyin bölgesini ortaya çıkarmak için bir kraniyotomi yapılarak gerçekleştirilir. İkinci adım, floresan boyayı hedef nöronların yansıttığı bölgeye yerleştirmek için tungsten teller kullanmaktır.
Daha sonra, boya retrograd olarak taşınır ve bu da projeksiyon nöronlarının seçici olarak etiketlenmesine neden olur. Son adım, bireysel projeksiyon nöronunun etiketli aksonundan kayıt yapmaktır. Sonuç olarak, sağlam bir devredeki merkezi duyusal nöronların evo'daki duyusal stimülasyona nasıl tepki verdiğini göstermek için tek birim hücre dışı kayıtlar kullanılır.
Bu yöntem, nöro devrelerin sinaptik girişlerin zamanlamasındaki milisaniyenin altındaki farklılıkları nasıl tespit ettiğine ilişkin temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bireysel nöronları ve hatta aksonları ve genetik olarak erişilebilir olmayan sistemleri hedefleme yeteneğidir. Haftalık elektrikli balıklar, iletişim ve navigasyon için elektrik sinyallerini kullanır.
Sinaptik girişlerin zamanlamasındaki milisaniyenin altındaki farkları kullanarak farklı balıklardan gelen sinyalleri ayırt ederler. Elektros duyusal devrelerindeki varsayılan zaman karşılaştırıcı nöronların bu kadar küçük zamanlama farklılıklarını nasıl tespit edebildiklerini sorduk. Ancak bu teknik, görsel ve işitsel duyu yolları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.
Çevredeki dokudaki küçük boyutlu, yoğun miring ve hücre göbeğinin çoğunu kaplayan presinaptik terminaller nedeniyle bu hücrelerden sıvı almak özellikle zordur Tüm hücre kaydı sırasında hücre içi boya enjeksiyonu. İn vitro etiketler, bu aksondan hedeflenen kayıtları yönlendirmek için tek bir hücre. Benzer şekilde, hücre dışı boya enjeksiyonunu takiben retrograd taşıma, yüzeysel beyin bölgelerindeki projeksiyon nöronlarını seçici olarak etiketlemek için bir araç sağlar.
Bu, in vivo tek ünite kayıtları için görsel rehberlik sağlamak için kullanılabilir. D kodlu iğneyi hazırlamak için önce 160 mikrometre çapında bir tungsten telini elektrolitik olarak keskinleştirin, son iğne ucu çapı beş ila 50 mikrometredir. Daha sonra deneyden önceki gece, iğne ucunu genel anesteziyi indüklemek için 10.000 moleküler ağırlıklı dekstran konjuge Alexa zemin boyasından oluşan iki milimolar bir çözelti ile kodlayın.
Balıkları MS ile tank suyuna yerleştirin 2 litre başına 300 miligramda 22 çözelti, sırt vücut kas sistemine mililitre başına üç miligramda 100 mikrolitre yelken açarak balığı hareketsiz hale getirin ve elektrikle susturun. Ardından, kayıt odasını tank suyuyla doldurun ve balığın ventral tarafı aşağı bakacak şekilde odanın ortasındaki platforma yerleştirin. Daha sonra havalandırılmış MS'yi verin 2 22 ağzına bir pipet ucu yerleştirerek dakikada bir ila iki mililitre içinde litre başına 100 miligram çözelti.
Daha sonra, balığı vücudun her iki tarafında sabit çubuklar ve balmumu ile sabitleyin. Oküler damarlardaki sürekli kan akışını ve normal vücut rengini kontrol ederek balığın sağlık durumunu izleyin. Ardından platformu dikey eksen boyunca döndürün.
Platformun bir ucunu, balığın kafasının sırt yüzeyinin bir tarafı suyun üzerinde açıkta kalacak ve balığın vücudunun geri kalanı su altında kalacak şekilde ayarlayın. Kurumayı önlemek için cildin suya batmamış herhangi bir kısmına küçük bir parça Kim mendili yerleştirin. Bu prosedürde, bir Q-ucu kullanarak başın açıkta kalan yüzeyine% 0.4 lidokain uygulayın.
Ardından, 6,2 santimetrelik bir balık için yaklaşık üç milimetreye beş milimetrelik dikdörtgen bir cilt dokusu parçasını kesmek için bir neşter bıçağı kullanın. Dikdörtgenin yan kenarı gözün merkezi ile aynı hizada olmalıdır. Dikdörtgenin ön kenarı gözün hemen arkasında olmalı ve dikdörtgenin medial kenarı orta hattın hemen yanında olmalıdır.
Daha sonra, bir çift forseps kullanarak dikdörtgeni çıkarın. Kafatasını ortaya çıkarmak için 2,5 milimetre kare daha ön mely kesin. Neşter bıçağını kullanarak fazla dokuyu kazıyarak kafatasının açıkta kalan yüzeyini tamamen temizleyin.
Ardından yüzeyi bir Kim mendili ve basınçlı hava ile tamamen kurulayın. Ardından, ön medial açıkta kalan kafatası bölgesine süper yapıştırıcı ile metal bir direk yapıştırın. Tutkal tamamen kuruyana kadar bekleyin.
0.5 santimetrelik bir balık için kafatasına yaklaşık iki milimetreye dört milimetrelik bir dikdörtgen çizmek için 6.2 milimetre çapında bilyalı değirmen karbür uçlu bir diş matkabı kullanın. Bundan sonra, dikdörtgenin çevresini neşter ve forseps ile kesin. Sonra kafatasını soyun.
Beyni açığa çıkarmak için, bir çift yaylı makas veya iğne kullanarak hem pigmentli dura mater'i hem de şeffaf pia mater'i kesin. Ardından, ön ekstra lateral çekirdeği ve posterior ekstra lateral çekirdeği ortaya çıkarmak için kesilen kısımları bir çift forseps ile çıkarın. Şimdi, daha önce hazırlanmış D kaplı bir iğne ile bir manipülatörü, ilgilenilen aksonları içeren hedef bölgenin üzerine yerleştirin.
Olgumuzda posterior ekstra lateral nükleus, iğneyi dokuya yaklaşık 25 mikrometre içeriye hızlı bir şekilde sokar. Boya 15 ila 30 saniye boyunca dağıldıktan sonra iğneyi geri çekin. Gerektiği kadar ek taze iğnelerle tekrarlayın.
Boyanın hedef bölge boyunca dağıtılması için her birini farklı bir yere yerleştirin. Daha sonra boşluktaki fazla boyayı Hickman'ın zil solüsyonu ile durulayın ve boya alımı ve taşınması için en az iki saat bekleyin. İlgilenilen aksonları görselleştirmek için, kayıt odasını balıkla birlikte dik sabit kademeli bir epi floresan mikroskobunun hedefinin altına yerleştirin.
Solunum solüsyonunu taze tank suyuna geçirin ve aynı akış hızını koruyun. Ardından topraklama kablosunun bir ucunu açıkta kalan beyin boşluğuna yerleştirin ve diğer ucunu kayıt kafası aşamasının toprağına bağlayın. Ardından, kuyruğun tabanının yanına bir çift kayıt elektrodu yerleştirin.
Ardından elektrotları bir diferansiyel amplifikatöre ve kayıt cihazına bağlayın. Elektrik organ deşarj komutunu veya EODC'yi izlemek için, etiketli aksonların tam yerini belirlemek için yer işaretleri olarak büyük kan damarları da dahil olmak üzere, düşük büyütmede görüntülenen beyin bölgesinin ölçekli bir taslağını hazırlayın. Önce D yerleşimini onaylamak için, oryantasyon için parlak alan aydınlatması ile tüm dokuyu görüntüleyin.
Ardından floresan aydınlatma ile görüntüleyin. Posterior ekstra lateral çekirdek dağınık etiketleme göstermelidir. Bundan sonra, yüksek büyütme altında, ön ekstra lateral çekirdeği, damarları yer işaretleri olarak yerleştirin.
Bir milimetre dış çap 0.58 milimetre iç çap kullanarak, yüzeye yakın etiketli bir akson ararken, floresan ışıkla aydınlatın. Filamentli Bo silikat kılcal cam. Beş milimetre uzunluğunda, dar bir şafta ve yaklaşık bir ila 2,4 mikrometre uç çapına sahip bir kayıt elektrodu çekin.
Elektrodu filtrelenmiş hickman'ın zil çözeltisi ile doldurun. Son uç direnci 16 ila 155 mega ohm aralığında olmalıdır. Elektrodu, basınç portu olan bir elektrot tutucusuna yerleştirin.
Bir manipülatöre monte edilmiş kafa aşamasına bağlayın. Ardından kafa aşamasını bir amplifikatöre bağlayın. Gösterilmeyen bir analogdan dijitale toplama cihazı, amplifikatörü bilgisayara bağlar.
Bundan sonra, elektrot hattına 30 milibar pozitif basınç uygulayın. Elektrodu doku yüzeyinden aksona doğru yavaşça ilerletin. Elektrot aksona yakın olduğundan, pozitif basınç, elektrot aksonun yanındayken aksonun hafif ama fark edilir bir hareketine neden olmalıdır.
Test uyaranlarının sunumu sırasında aktiviteyi kaydedin. Bir elektriksel artefakt uygun kayıt ve stimülasyonu doğrulasa da, hiçbir aksiyon potansiyeli olmamalıdır. Elektrottaki dışa doğru basıncı serbest bırakın ve stimülasyonu ve kaydı tekrarlayın.
Daha sonra aksonun elektrot içine hareket etmesine neden olacak şekilde hafif bir emme uygulayın. Stimülasyonu ve kaydı tekrarlayın. Şimdi, stimülasyonlara yanıt olarak bazı aksiyon potansiyellerini görmelisiniz.
Aksiyon potansiyelleri göründüğünde, basınç hattını kapatın. İstenen tüm kayıtlar tamamlandığında, balığın tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için tank suyunu MS 2 22 litre başına yüz miligramda solunum solüsyonuna geri getirin. Balığa ötenazi yapılmadan önce en az 10 dakika boyunca hiçbir EODC tespit edilmemelidir.
Burada, santimetre başına 0.1 milisaniye altı milivolt, monofazik kontralateral pozitif enine kare darbe uyaranı tarafından uyandırılan aksiyon potansiyellerini gösteren beş örnek izi ve burada, santimetre başına altı milivolt uyaranla sıfır kez uyarılan aynı birim için 75 milisaniyelik bir kayıt penceresinin 20 tekrarı sırasında ani yükselme sürelerini gösteren bir raster grafiği bulunmaktadır. Süre aralığı sağ tarafta listelenmiştir. Burada, tepkileri uyaran tekrarı başına ani artışlar olarak ölçen bir uyaran süresi ayarlama eğrisi gösterilmektedir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknikte gösterilen ameliyat ve boya enjeksiyonu, uygun şekilde yapılırsa bir saat içinde yapılabilir ve boya enjeksiyonundan iki ila üç saat sonra kayıtlar başlatılabilir. Bu prosedürü denerken, bu prosedürü takiben deney hayvanının sağlığını dikkatlice izlemeyi unutmamak önemlidir. Daha derin beyin yapılarındaki nöronlardan kayıt yapmak için iki foton görüntüleme gibi başka yöntemler de yapılabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, tanımlanmış bir nöron popülasyonundan tek birim yanıtların nasıl etiketleneceğini ve kaydedileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Genel Bakış
Bu makale, in vivo olarak tanımlanmış nöronlardan tek birim yanıtlarını kaydetmek için geriye doğru fluoresan boya taşıma yöntemini sunmaktadır. Bu teknik, projeksiyon nöronlarının seçici etiketlenmesine izin vererek, genetik olmayan model sistemlerde hedefli ekstrasellüler kayıtların yapılmasını kolaylaştırmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Elektrofizyoloji
- Nöronal Devreler
Arka Plan
- Belirli nöronlardan kayıt yapmak, sinir devrelerini anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel yöntemler, genetik olmayan sistemlerde nöronları etkili bir şekilde etiketlememektedir.
- Floresan boya, nöronları anatomik projeksiyonlarına göre etiketlemek için kullanılabilir.
- Bu yaklaşım, özellikle elektrikli balıklarda duyu nöronlarının incelenmesi için yararlıdır.
Çalışmanın Amacı
- Tanımlanmış nöronlardan in vivo kayıt yapma yöntemi geliştirmek.
- Duyu nöronlarının uyaranlara nasıl yanıt verdiğini araştırmak.
- Karmaşık dokularda bireysel nöronları hedefleme yeteneğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- İlgili beyin bölgesini ortaya çıkarmak için kraniotomy.
- Projeksiyon nöronlarını etiketlemek için hedef alanlara fluoresan boya enjeksiyonu.
- Presiz boya yerleşimi için tungsten tellerin kullanımı.
- Nöronal yanıtları değerlendirmek için etiketli aksonlardan ekstrasellüler kayıt.
Ana Sonuçlar
- Boyanın geriye doğru taşınması kullanılarak projeksiyon nöronlarının başarılı bir şekilde etiketlenmesi.
- Tanımlanmış nöronlardan tek birim yanıtlarını kaydetme yeteneği.
- Tekniğin duyu devrelerinde zamanlama farklılıklarını incelemede uygulanabilirliğini gösterdi.
- In vivo hedefli kayıtlar için görsel rehberlik sağladı.
Sonuçlar
- Bu yöntem, genetik olmayan sistemlerdeki belirli nöronlardan hedefli kayıtlara izin vermektedir.
- Bu yaklaşım, elektrikli balıkların ötesinde çeşitli duyu yollarına uygulanabilir.
- Bu, karmaşık doku ortamlarında geleneksel yöntemlere göre önemli bir avantaj sunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables targeted single-unit recordings from identified neurons in non-genetic model systems, addressing a key challenge in neuroscience research where genetic tools are unavailable. By using retrograde fluorescent labeling based on axonal projections, researchers can pre-visualize and selectively record from specific neuronal populations, improving the reliability and interpretability of electrophysiological data. This capability supports mechanistic de-risking in target validation by linking neuronal identity to function in intact circuits, which is valuable for preclinical neuroscience and translational biomarker discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking neuronal identity to electrophysiological function in vivo.
- Operational Value: Provides a visual cue for targeted recordings, reducing blind sampling and increasing data quality in heterogeneous tissues.
- Predictive Confidence: Supports biological de-risking by confirming that recorded signals originate from anatomically defined projection neurons.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Creates a standardized, reproducible system for preparing labeled neurons for downstream electrophysiological assessment.
- Quantitative Output: Enables measurement of single-unit responses to sensory stimuli, providing actionable data for compound screening.
- Platform Reuse: The retrograde labeling approach can be adapted across brain regions and model systems, supporting scalable use in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Applicable to sensory processing circuits, offering insight into neural mechanisms of stimulus detection and timing discrimination.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling consistent identification of neuronal targets across experimental sessions.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces false positives in target validation by ensuring recordings are obtained from the intended neuronal population.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven interrogation of neural circuits before moving to lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing researchers to record from neurons defined by their projection patterns, clarifying functional roles in sensory processing.
- Screening: Generates reproducible, quantifiable electrophysiological readouts that can be used to assess neuronal responses under controlled conditions.
- Analytics: Produces spike timing and duration tuning curves that enable quantitative comparison of neuronal responses across stimuli or conditions.
- Translational Research: Supports continuity from circuit-level discovery to preclinical models by providing a reliable method to identify and re-target specific neurons.
- Enterprise Reuse: The core technique of retrograde dye labeling is adaptable to various brain regions and species, making it a reusable capability across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through anatomically precise targeting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of single-unit recordings via pre-visualization of target neurons.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in early discovery by increasing the likelihood that observed phenotypes are linked to the intended neuronal target.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated neuronal identity and function in intact circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, microsurgery, and in vivo electrophysiology.
- Depends on access to fluorescence microscopy, micromanipulators, and extracellular recording equipment.
- Necessitates standardization of dye injection parameters and transport times across users and labs.
- Must account for variability in axonal projection patterns when applying the method to new model systems or brain regions.
- Practical limitations include dependence on successful retrograde transport, which may vary by tissue health and dye properties.
