Name: Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir In vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Öğrenin retrograd floresan etiketleme ile canlı hayvanlarda belirli nöronlardan tek üniteli kayıt yapma yöntemini. Bu teknik, genetik olmayan sistemlerde hedeflenmiş hücre dışı kayıtlara olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

TK G2205 (Bilim Teşvik Ulusal Bilim Vakfı (BAC için IOS-1.050.701), Ulusal Sağlık Enstitüleri (SM için NS54174 ve AML-W F30DC0111907.), Uehara Memorial Foundation ve Japon Derneği tarafından sağlanan finansman .) Biz hücre dışı aksonal kayıtların konuda verdiği destek ve rehberlik için Julian Meeks teşekkür ederim. Biz bir prototip kayıt odasına sağlamak için Carl Hopkins teşekkür ederim.

<ol><li>Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+fidelity+during+normal+and+epileptiform+activity+in+paired+soma-axon+recordings+from+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus.</a> J. Physiol. 566, 425-441 (2005).</li>
<li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control%3A+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> J. Neurosci. Methods. 65, 113-136 (1996).</li>
<li>Joshi, S., Hawken, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loose-patch-juxtacellular+recording+in+vivo--a+method+for+functional+characterization+and+labeling+of+neurons+in+macaque+V1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Loose-patch-juxtacellular recording in vivo--a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1.</a> J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).</li>
<li>Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+whole-cell+recordings+in+the+mammalian+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo.</a> Neuron. 39, 911-918 (2003).</li>
<li>Lima, S. Q., Hromádka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+A+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, e6099(2009).</li>
<li>Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potentials+initiate+in+the+axon+initial+segment+and+propagate+through+axon+collaterals+reliably+in+cerebellar+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons.</a> J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).</li>
<li>Lehman, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+as+a+transneuronal+tracer%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus as a transneuronal tracer.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).</li>
<li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dogged+pursuit+of+coincidence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A dogged pursuit of coincidence.</a> J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).</li>
<li>Heiligenberg, W., Rose, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+and+amplitude+computations+in+the+midbrain+of+an+electric+fish%3A+Intracellular+studies+of+neurons+participating+in+the+jamming+avoidance+response+of+Eigenmannia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia.</a> J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).</li>
<li>Morales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Releasing+the+peri-neuronal+net+to+patch-clamp+neurons+in+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+European+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS.</a> Pflügers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).</li>
<li>Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+for+species+recognition+in+the+time-coding+electrosensory+pathway+of+mormyrid+electric+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural substrates for species recognition in the time-coding electrosensory pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Neurosci. 18, 1171-1185 (1998).</li>
<li>Hitschfeld, ÉM., Stamper, S. A., Vonderschen, K., Fortune, E. S., Chacron, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+restraint+and+immobilization+on+electrosensory+behaviors+of+weakly+electric+fish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR.+J%22%5BJournal%5D)">Effects of restraint and immobilization on electrosensory behaviors of weakly electric fish.</a> ILAR. J. 50, 361-372 (2009).</li>
<li>Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+mechanisms+of+temporal+analysis+in+the+knollenorgan+pathway+of+mormyrid+electric+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).</li>
<li>Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+coding+in+the+midbrain+of+mormyrid+electric+fish.+I.+Physiology+and+anatomy+of+cells+in+the+nucleus+exterolateralis+pars+anterior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%3A+Neuroethol+Sens+Neural.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior.</a> J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).</li>
<li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+making+very+fine%2C+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull World Health Organ. 2, 143-144 (1965).</li>
<li>Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal-pattern+recognition+by+single+neurons+in+a+sensory+pathway+devoted+to+social+communication+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal-pattern recognition by single neurons in a sensory pathway devoted to social communication behavior.</a> J. Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).</li>
<li>Mugnaini, E., Maler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytology+and+immunocytochemistry+of+the+nucleus+extrolateralis+anterior+of+the+mormyrid+brain%3A+possible+role+of+GABAergic+synapses+in+temporal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis.</a> Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).</li>
<li>Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+submillisecond+spike+timing+differences+based+on+delay-line+anticoincidence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection.</a> J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).</li>
<li>Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+tracer+in+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system.</a> Brain Res. 486, 334-339 (1989).</li>
<li>Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+neuronal+marker+for+in+vivo+and+in+vitro+studies+of+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex.</a> Nature. 310, 498-500 (1984).</li>
<li>Brown, S. P., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracortical+circuits+of+pyramidal+neurons+reflect+their+long-range+axonal+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets.</a> Nature. 457, 1133-1136 (2009).</li>
<li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).</li>
<li>Pollak, G. D., Burger, R. M., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+circuitry+of+the+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dissecting the circuitry of the auditory system.</a> Trends Neurosci. 26, 33-39 (2003).</li>
<li>Wurtz, R. H., Albano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual-motor+function+of+the+primate+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visual-motor function of the primate superior colliculus.</a> Annu. Rev. Neurosci. 3, 189-226 (1980).</li>
<li>O'Malley, D. M., Zhou, Q., Gahtan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+neural+circuits+in+the+zebrafish%3A+a+suite+of+optical+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Probing neural circuits in the zebrafish: a suite of optical techniques.</a> Methods. 30, 49-63 (2003).</li>
<li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain Res. Bull. 51, 11-28 (2000).</li>
<li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li>
<li>Gahtan, E., O'Malley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+lesioning+of+large+numbers+of+identified+vertebrate+neurons%3A+applications+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid lesioning of large numbers of identified vertebrate neurons: applications in zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 108, 97-110 (2001).</li>
<li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lucifer+Yellow+slows+voltage-gated+Na%2B+current+inactivation+in+a+light-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice.</a> J. Physiol. 550, 159-167 (2003).</li>
<li>Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosc%22%5BJournal%5D)">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).</li>
<li>Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+and+external+application+of+photodynamic+sensitizers+on+squid+giant+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons.</a> J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).</li>
<li>Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spine+stabilization+and+synaptic+enhancement+at+the+onset+of+behavioural+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning.</a> Nature. 463, 948-952 (2010).</li>
<li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+nonlinear+optical+imaging%3A+beyond+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li>
<li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bir kere hakim, bu teknik bir çok model sistemler in vivo kayıtlarında için ayrı akson dahil olmak üzere tespit nöronlar, hedef sağlayacaktır. Buna ek olarak, bu teknik bir güvenilir zorlu in vivo kayıt yöntemleri geleneksel sağlayan benzersiz anatomik özelliklere sahip nöronlardan başak çıkış kaydetmenize olanak verir. Biz mormyrid zayıf elektrik balık ELa &quot;küçük hücreler&quot; den kaydetmek için bu tekniği kullanmış olurlar. &quot;Küçük hücreler&quot; ayar özelliklerini incelemek için önceki girişimler zorlu kayıt koşullarına 11, 14 nedeniyle başarısız oldu. Benzer anatomik özellikleri çok farklı omurgalı işitsel ve electrosensory nöronlar 8-10 tek birim kayıtları elde etmek için engeller oluşturmak. Sistemimizde bu zorlukları aşmak için, &quot;küçük hücreler&quot; bu ELa tek hücrelerin olduğu gerçeğini yararlandı ELP proje. Böylece, ELP yerleştirilir boya retrograd taşıma &quot;küçük ELa Etiketleme sınırlarhücre &quot;somas ve akson. akson Floresan etiketleme erişilemez somas rağmen mümkün tespit hücrelerinden tek birim kayıtları yapma, etiketli aksonlar yanında hassas elektrot yerleştirme izin verdi. Biz çevredeki yutma sinaps 11 nedeniyle muhtemelen, somatik kayıtları çalıştı, ancak başarısız oldu , 17. Bununla birlikte, açıkça bu somatik etiketleme tekniği diğer hücre türleri ve diğer devreler somatik kayıtları hedeflemek için kullanılabilir düşündüren görünür hale geldi. in vivo olarak geriye doğru aktarıma yoluyla nöronların fluoresan etiketleme in vitro 19-21 hedeflenen kayıtları ilerletilmesi için kullanılmaktadır . Benzer bir teknik zebrabalıkları omurilik 22 motor nöronların in vivo kayıtları hedeflenen için kullanılmıştır. Çalışmalarımız, etiketleme ve kayıt hem de beyinde in vivo yapılmaktadır ki, bu yaklaşım için yeni bir genişleme gösterir. Bizim yöntemi gösteren in vivo bir retrograd t MSS alanların etiketlemeyarışçı benzer seçici projeksiyon nöronları ile diğer sağlam devrelerin çalışma genişletilebilir. Örneğin, memeli işitsel işleme, alt kollikulus (IC) birden fazla rhombencephalic yapılar 23 girişleri için önemli bir aktarma merkezi olarak hizmet vermektedir. IC içine enjeksiyondan seçici bu çekirdeklerin her birinden projeksiyon hücreleri etiketlemek olacaktır. Üstün colliculus (SC) vizyon 24 için benzer bir işlev görür. Omurilik preparatlar özellikle omurilik kolayca erişilebilir olduğu gibi, boya püskürtme kadar kayıt sitesinden oluşabilir, bu yöntem için uygun olan, ve daha detaylı bilgiler anatomik 25 elde etmek için seçme nöronların hücre içi kayıt ve doldurma ile kombine edilebilir. Son olarak, sistem-izleme karmaşık devre 26 eşleştirmek için merkezi sinir sistemi boyunca kullanılan iyi kurulmuş bir tekniktir. Bizim yöntemi w yapılmıştır bu çalışmalara işlevsel bilgi eklemek için kullanılabilirkedi görsel korteks 27. ith kalsiyum duyarlı göstergeler. Iyi kurulmuş olan cerrahi, güvenilir ve düzenli in vivo kayıtları 16 kör için kullanılan, minimal kanama ve hayvan ve hayatta kalmak için doku sağlamak için beynin yüzeyine zarar ile tamamlanması gerekir. Uygulama ile, cerrahi ve boya uygulama 30-45 dakika içinde tamamlanabilir. Biz başarıyla hazırlıkları% 67 in &quot;küçük hücreli&quot; akson etiketli. En hazırlıkları sadece 1 veya 2 görünür etiketli aksonlar var, ancak bazı olarak 8 var. Teşebbüs 119 etiketli birimlerinin, biz 12 preparatları (Tablo 2) üzerinden dağıtılan 26 birimlerden tek birim kayıtları elde. Böylece, veri% 28 genel başarı oranı için etiketli akson ile hazırlıkları 41% toplanmıştır. Boya uygulamasının kritik yönü derinliği etiketleme. Tungsten telinin Sığ ekleme yıkanmış w olan boya ile sonuçlanacaktıray. Penetrasyon çok derin ise, ancak, etiketli akson hedef görebilir olmayacaktır. Bundan başka, hücre için bazı mekanik hasar yeterince 25, 28 ele alınması boya için gerçekleşmelidir. Ancak, çok fazla zarar hücreleri öldürür. Biz ELP etiketlenmesine akson (Tablo 3) kayıt ile eşleştirilmiş ELa içine boya enjeksiyon yoluyla anterograd etiketleme dahil olmak üzere diğer boyalar ve diğer yöntemlerle (Tablo 2), ile etiketleme çalıştı. Biz etiketleme onlara tepkisiz hale somatik hasar hücrelerin sınırlı olduğu için ileriye etiketleme başarılı olmadığını hipotez. Buna ek olarak, pre-sinaptik terminalleri rahatsız olabilir. Buna karşılık, retrograd etiketleme bu endişeleri her iki en aza indirir. Miktarı ve boya uygulama yer çalışılmaktadır belli bir devre uygun olarak modifiye edilebilir. Maksimal etiketleme biz kaplanmış tungsten tellerin kullanılarak elde büyük boya konsantrasyonu oluşur. Ancak de olan aksonlar Etiketlemebu gelişmiş olduğu gibi ep projeksiyonlar, boya bir tungsten iğne yerinden çıkabilir. Bu durumda, basınçlı enjeksiyon daha uygun olacaktır. Boya alımı ve ulaşım 2 saat sonrası enjeksiyon ve 6 saat sonrası enjeksiyon gibi geç görünen ek etiketli akson gibi erken görünür olmak bizim hazırlık etiketli akson ile, hızlıdır. Böylece, etiketleme ve kayıt hayatta kalma cerrahi ile ilgili teknik sorunlar ortadan kaldırarak, tek bir gün içinde yapılabilir. Zamanlama boya nakil için gerekli olan mesafeye bağlı olarak, her uygulama için değişecektir. Diğer önemli yönü elektrot yerleştirilmesidir. Bu ucu tıkanmasını önlemek için etiketli akson siteye doku yakın girmek için önemlidir. Bu ELa gibi yoğun doku için, kayıt elektrot üzerinde uzun, ince bir sap çevre dokulara aşırı hareketi en aza indirir. Başarılı bir kayıt bir kayıt elde edilene kadar taze elektrotlar ile ilk denemede, tekrar üzerinde elde veya tiss değilseue akson artık görünür hangi noktaya bozulur. Bununla birlikte, hızlı bir şekilde ağartma fototoksisite neden maruz floresan, miktarını en aza indirmek için ve hücre 29-31 fizyolojik özelliklerini etkileyebilir akson yanındaki elektrot yerleştirmek için de önemlidir. Akson bir bölümünü başarıyla kayıt elektrot içine emilmekte sonra, kayıtlar birkaç saat boyunca elde edilebilir. Birimleri sürekli az 1 saat içinde kaybolur üzerinden kaymasını akson önlemek için küçük elektrot uçları yapmayı düşünün. Öte yandan, bir ucu çok küçük akson için tıkanma, düşük sinyal-gürültü, ya da hasara neden olabilir. Başak genlik ve ek emme ile bir birimin &#39;dönüş&#39; bir sürekli azalma ucu çok büyük bir göstergesidir. Çok fazla emme akson onarılamaz hasara neden olabilir. Bir çözüm, basınç yavaş yavaş sıfıra döner böylece hava hattı küçük bir sızıntı sağlamaktır. Hızla inci dengelemee basınç akson sınırdışı edebilir geçici bir akraba-dışa &#39;itme&#39; verilecektir. Bu teknik belirlenen projeksiyon nöronlardan hedeflenen kayıtları elde etmek için büyük bir avantaj sağlamasına rağmen boya enjeksiyon sitesinde tüm hücre tipleri tarafından alınması gibi, bu, yerel internöronlar ayırt için yararlı olmayacaktır. Teorik olarak, ayrı enjeksiyon siteleri ile birden fazla fluorophores kullanımı bu yöntem genişletilebilir izin verebilir. Örneğin, tek-veya çift-etiketleme karşılaştırma devresi 32, iki nokta, çift enjeksiyonları ardından projeksiyon nöronlarının ikinci internöron ayırt etmek için kullanılabilir. Benzer şekilde, retrograd izleyiciler zebra ispinoz Yüksek Vokal merkezi (HCV) 32 son zamanlarda yapıldı gibi iki foton görüntüleme gibi diğer gelişmiş görüntüleme teknikleri,, ile kombine edilebilir. Epifloresans mikroskop kullanırken Ayrıca, kayıt bölgeleri biz sadece ve 1 çözmek mümkün olduğu gibi, yüzeye yakın olanlar ile sınırlıdırmu, doku ilk 30 mikron içinde m yapılar. Ancak, bu derinliği gibi iki foton mikroskopi 33 veya objektif-birleştiğinde düzlemsel aydınlatma mikroskobu 34 gibi diğer mikroskopi teknikleri kullanımı yoluyla genişletilebilir. Nispeten erişilebilir olduğunu da dahil olmak üzere - bu model sistemler çeşitli birçok farklı devrelerinde tek nöronlardan kaydetmek için kullanılabilir, çünkü genel olarak, bu teknik, in vivo olarak nöral devrelerin çalışma önemli bir gelişmeyi temsil etmektedir.

<table><tbody><tr><td>Trikain Metansülfonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>Gallamin Trietiyodür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8134</td><td>Flaxedil</td></tr><tr><td>Lidokain Hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5647</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hickman&amp;rsquo;s Ringer Solüsyonu</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 (0.29 g/l), MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0.12 g/l), NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (0.084 g/l), NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0.06 g/l)</td></tr><tr><td>Peristaltik Pompa</td><td>Gilson veya Rainin</td><td>Minipulse 3 Model 312; RP-1</td><td>10.0 &amp;plusmn; 1.0 rpm; Alternatif olarak, debimetreye sahip yerçekimi beslemeli hat</td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Süper Yapıştırıcı</td><td>Super Glue Corporation</td><td>SGH2</td><td>2g tüp</td></tr><tr><td>Omni Drill 35</td><td>World Precision Instruments</td><td>503-598</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bilyalı Değirmen Karbür Matkap Ucu #1/4</td><td>World Precision Instruments</td><td>501860</td><td>0.19 DIA (uç çapı = 0.48 mm)</td></tr><tr><td>Düşük Sıcaklık Koterizasyon Kiti</td><td>World Precision Instruments</td><td>500391</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Manuel Mikromanipülatör</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dekstran Konjuge Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>D-22912</td><td>2mM konsantrasyon; 10,000MW Boya dalga boyu seçimi, mikroskop filtre ayarlarıyla uyumlu olacak şekilde yapılmalıdır</td></tr><tr><td>Epifloresan Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>E600 FN</td><td>Hassas odaklama için uzak odaklama aksesuarı faydalıdır; TRITC filtresi - veya farklı boya dalga boyları için odak düzlemleriyle uyumlu uygun filtre</td></tr><tr><td>Düşük Güçlü Objektif</td><td>Nikon</td><td>93182</td><td>CFI Plan Achromat Serisi, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm</td></tr><tr><td>Yüksek Güçlü Objektif</td><td>Nikon</td><td>93148</td><td>CFI Fluor Serisi, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm</td></tr><tr><td>Beyaz Işık Kaynağı</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Model 190</td><td>Fiber Optik Aydınlatıcı</td></tr><tr><td>Floresan Işık Kaynağı</td><td>Lumen Dynamics</td><td>X-Cite 120Q</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Düşük Işık Seviyeli Kamera</td><td>Photometrics</td><td>CoolSnap ES</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dijital Manometre</td><td>Omega Engineering</td><td>HHP-201</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Motorize Mikromanipülatör</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>Amplifikatör</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>Veri Toplama Sistemi</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>İzole Puls Stimülatörü</td><td>A-M Systems</td><td>2100</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alevli/Brown Mikropipet Çekici</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Uygulamamız için program ayarları: Heat: ramp + 1, Pull: &amp;rsquo;0&amp;rsquo;, Velocity: 60, Time: 90 Kutu filament</td></tr><tr><td>Pipet Camı</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Filamentli borosilikat kapiler cam (1 mm OD, 0.58 mm ID)</td></tr></tbody></table>

retrograd floresan etiketleme belirlenen nöronlar gelen hedefli hücre dışı tek ünitesi kayıt izin verir<em&gt; in vivo</em

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Bu yöntemin genel amacı nöronların tanımlanmış bir nüfus tek ünite, kaydetmektir. Bireysel nöronlar in vivo elektrofizyolojik olarak nöral devrelerin doğal şartlar altında nasıl çalıştığını anlamak için önemlidir. Geleneksel olarak, bu kayıtları kaydedilen hücrenin kimliğini kaydın başlangıcında bilinmemektedir yani, &#39;kör&#39; yapılmıştır. Hücresel kimlik ardından hücre içi juxtacellular 1, 2 ya da gevşek yama boya 3 iyontoforez vasıtasıyla tespit edilebilir, ancak bu kayıtlar fonksiyonel farklılıklar hücre tipleri ile bölgelerindeki özel nöron için önceden hedeflenen edilemez. Floresan proteinleri görsel güdümlü tek hücreli elektrofizyoloji 4-6 izin veren bir hücre tipi özel bir şekilde ifade edilebilir. Ancak, bu genetik araçlar mevcut değildir kendisi için birçok model sistemler vardır. Hatta genetik kolay kullanılabilir sistemlerde, istenen promoter bilinmeyen olabilir veya genetik olarak homojen nöronların projeksiyon modelleri farklı olabilir. Benzer şekilde, viral vektörler projeksiyon nöronlarının 7 belirli alt etiketlemek için kullanılmaktadır, ancak bu yöntem kullanımı trans-sinaptik özgüllük toksisite ve yokluğu yüzünden kısıtlıdır. Böylece, in vivo olarak tanımlanan tek nöronlardan kaydetmek için özel ön-görselleştirme sunan ek teknikler ihtiyaç vardır. Hedef nöron Ön görüntüleme klasik tek hücre kayıtları genellikle 8-11 engelleyici zor olan kayıt için zorlayıcı koşulları için özellikle yararlıdır. Bu yazıda anlatılan roman tekniği böylece hedef elektrofizyolojik elde etmek için görsel bir ipucu sağlayan, hızlı ve seçici kendilerine özgü aksonal projeksiyonlar göre belirli bir beyin bölgesi içindeki hücrelerin belirli bir alt etiket tungsten iğne kullanarak bir floresan boya retrograd taşıma uygulandı kullanır sağlam bir devre withi tespit nöronlardanna MSS omurgalı. Bizim yöntemin en önemli yeni bir gelişme, bir sigara genetik olarak erişilebilir bir model sistemde özel hücre tipleri hedef floresan etiketleme kullanılmasıdır. Zayıf elektrik balık hayvanlar 12 davranıyor, uyanık nöral devreleri eğitim için mükemmel bir model sistem bulunmaktadır. Biz zayıf elektrik mormyrid balık ön exterolateral çekirdeğinde &quot;küçük hücreler&quot; (ELa) tarafından duyusal işleme incelemek için bu teknik kullanılmaktadır. &quot;Küçük hücreler&quot; presinaptik sivri 13 gelişi zamanlarda submillisecond farklılıkları tespit etmek için önemli bir zaman karşılaştırma nöronlar olduğu öne sürülmüştür. Ancak, bu tür yoğun miyelin, içine çeken sinaps ve küçük hücre gövdeleri gibi anatomik özellikleri son derece zor geleneksel yöntemlerle 11, 14 kullanılarak bu hücrelerden kayıt yaptık. Burada güvenilir, sağlam kayıtları ve karakteristiklerini sağlayan, bizim yeni bir yöntem seçerek hazırlıkları 28% bu hücrelerin etiketler göstermektedirelectrosensory uyarıya yanıtların zasyon.

Floresan boya retrograd taşıma anatomik projeksiyona dayalı nöronların bir alt-nüfus etiketler. Etiketli akson görsel olarak hedeflenebilir<em&gt; In vivo</em&gt;, Belirlenen aksonlardan ekstraselüler bir kayıt izin verir. Bu teknik nöronlar genetik manipülasyon yoluyla etiketli ya da izole etmek zor olamaz zaman &#39;kör&#39; kullanarak kayıt kolaylaştırır<em&gt; In vivo</em&gt; Yaklaşımlar.

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

Bu yöntemin genel amacı, tanımlanmış bir nöron popülasyonundan tek ünite yanıtlarını kaydetmektir. ...'den yapılan in vivo elektrofizyolojik kayıtlar...

Bu prosedürün genel amacı, genetik olmayan bir model sistemdeki belirlenmiş bir nöron popülasyonundan in vivo tek ünite yanıtlarını kaydetmektir. Bu, öncelikle ilgili beyin bölgesini açığa çıkarmak için bir kraniyotomi gerçekleştirilerek sağlanır. İkinci adım, hedef nöronların projeksiyon yaptığı bölgeye floresan boya yerleştirmek için tungsten tellerin kullanılmasıdır.Ardından, boya retrograd olarak taşınır ve bu da projeksiyon nöronlarının seçici olarak işaretlenmesiyle sonuçlanır. Son adım, tekil projeksiyon nöronunun işaretlenmiş aksonundan kayıt almaktır. Nihayetinde, sağlam bir devre içerisindeki merkezi duyusal nöronların evo'daki duyusal uyarana nasıl yanıt verdiğini göstermek için tek üniteli ekstraselüler kayıtlar kullanılır.Bu yöntem, nöral devrelerin sinaptik girdilerin zamanlamasındaki milisaniye altı farkları nasıl tespit ettiğine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tekil nöronları, hatta aksonları ve genetik olarak erişilemeyen sistemleri hedefleyebilme yeteneğidir. Zayıf elektrikli balıklar, iletişim ve navigasyon için elektrik sinyallerini kullanırlar.Sinaptik girdilerin zamanlamasındaki milisaniyenin altındaki farkları kullanarak farklı balıklardan gelen sinyalleri ayırt ederler. Elektrosensör devrelerindeki varsayılan zaman karşılaştırıcı nöronların bu kadar küçük zamanlama farklarını nasıl tespit edebildiğini araştırdık. Ancak bu teknik, görsel ve işitsel duyusal yollar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Hücrelerin küçük boyutu, çevreleyen dokuyla yoğun şekilde iç içe geçmiş olmaları ve hücre gövdesinin büyük kısmını kaplayan presinaptik terminaller nedeniyle bu hücrelerden sıvı elde etmek özellikle zordur. Tüm hücre kaydı sırasında yapılan hücre içi boya enjeksiyonu, söz konusu aksondan hedefli kayıtlar yapabilmek için in vitro ortamda tek bir hücreyi işaretler. Benzer şekilde, hücre dışı boya enjeksiyonunu takip eden retrograd transport, yüzeysel beyin bölgelerindeki projeksiyon nöronlarının seçici olarak işaretlenmesi için bir yöntem sağlar.Bu yöntem, in vivo tek ünite kayıtları için görsel kılavuz sağlamak amacıyla kullanılabilir. D kodlu iğneyi hazırlamak için öncelikle, 160 µm çapındaki bir tungsten teli, nihai iğne ucu çapı 5 ila 50 µm olacak şekilde elektrolitik olarak sivriltin. Ardından, deneyden bir gece önce, genel anesteziyi indüklemek için iğne ucunu 10.000 moleküler ağırlıkta, Alexa fluor boyasıyla konjuge edilmiş 2 mM'lık bir dekstran çözeltisi ile kodlayın.Balığı, 300 mg/L MS 2 22 çözeltisi içeren tank suyuna yerleştirin; dorsal vücut kas dokusuna 3 mg/mL konsantrasyonunda 100 µL flail enjekte ederek balığı immobilize edin ve elektriksel olarak sessizleştirin. Ardından, kayıt odasını tank suyu ile doldurun ve balığı odanın merkezindeki platforma ventral tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Daha sonra, bir pipet ucunu ağzına yerleştirerek, 100 mg/L konsantrasyonundaki havalandırılmış MS 2 22 çözeltisini dakikada 1 ila 2 mL hızında verin.Ardından, balığı gövdesinin her iki yanından sabit çubuklarla ve mumla sabitleyin. Oküler damarlardaki sürekli kan akışını ve normal vücut rengini kontrol ederek balığın sağlık durumunu izleyin. Daha sonra platformu dikey eksen boyunca döndürün.Platformun bir ucunu, balığın başının dorsal yüzeyinin bir tarafı suyun üzerinde kalacak, vücudunun geri kalanı ise su altında kalacak şekilde ayarlayın. Kurumayı önlemek için cildin su altında kalmayan herhangi bir bölümüne küçük bir parça Kim wipe yerleştirin. Bu prosedürde, başın açıkta kalan yüzeyine bir kulak çubuğu kullanarak %0,4 lidokain uygulayın.Ardından, 6,2 cm boyutundaki bir balık için yaklaşık üç milimetre çarpı beş milimetre boyutlarında dikdörtgen şeklinde bir deri dokusu parçasını kesmek için bir neşter ucu kullanın. Dikdörtgenin lateral kenarı gözün merkeziyle aynı hizada olmalıdır. Dikdörtgenin anterior kenarı gözün hemen posteriorunda, medial kenarı ise orta hattın hemen lateralinde olmalıdır.Ardından, bir pens yardımıyla dikdörtgen parçayı çıkarın. Kafatasını açığa çıkarmak için anterior melli bölgeden ek olarak 2,5 milimetrelik bir kare kesin. Skalpel bıçağını kullanarak fazla dokuları sıyırıp açığa çıkan kafatası yüzeyini tamamen temizleyin.Ardından yüzeyi bir Kim wipe ve basınçlı hava ile tamamen kurulayın. Sonrasında, metal bir postu hızlı yapıştırıcı kullanarak kafatasının anterior medial açık bölgesine yapıştırın. Yapıştırıcı tamamen kuruyana kadar bekleyin.6,2 santimetrelik bir balığın kafatasında, 0,5 milimetre çapında küresel uçlu karbür freze kullanılan bir diş hekimi matkabı ile yaklaşık iki milimetreye dört milimetre boyutlarında bir dikdörtgen çizin. Ardından, dikdörtgenin çevresini bistüri ve penset yardımıyla kesin. Sonrasında kafatasını soyarak ayırın.Beyni açığa çıkarmak için, yaylı makas veya bir iğne kullanarak hem pigmente dura materi hem de şeffaf pia materi kesin. Ardından, anterior ekstra lateral nükleus ve posterior ekstra lateral nükleusu açığa çıkarmak için kesilen kısımları bir penset yardımıyla uzaklaştırın. Şimdi, daha önce hazırlanmış D kaplı bir iğneye sahip manipülatörü, ilgilenilen aksonları içeren hedef bölgenin üzerine yerleştirin.Vakamızdaki posterior ekstra lateral nukleus için iğneyi hızla yaklaşık 25 micrometers doku içine yerleştirin. Boya 15 ila 30 saniye boyunca difüze olduktan sonra iğneyi geri çekin. Gerektiğinde yeni iğnelerle işlemi tekrarlayın.Boyanın hedef bölgeye yayılmasını sağlamak için her birini farklı bir konuma yerleştirin. Ardından, boşluktaki fazla boyayı hickman's ringer çözeltisi ile yıkayın ve boyanın alınması ve taşınması için en az iki saat bekleyin. İlgili aksonları görüntülemek için, balığın bulunduğu kayıt odasını dik sabit tablası olan bir epi floresan mikroskobun objektifinin altına yerleştirin.Respirasyon solüsyonunu taze tank suyuyla değiştirin ve aynı akış hızını koruyun. Ardından, topraklama telinin bir ucunu açığa çıkarılmış beyin boşluğuna yerleştirin ve diğer ucunu kayıt kafa aşamasının toprağına bağlayın. Son olarak, kuyruk tabanının yanına bir çift kayıt elektrodu yerleştirin.Ardından elektrotları bir diferansiyel amplifikatöre ve kayıt cihazına bağlayın. Elektrik organ boşalım komutunu veya EODC'yi izlemek için, etiketli aksonların tam konumunu belirlemede referans noktaları olarak kullanılacak ana kan damarlarını içeren, düşük büyütmede görüntülenen beyin bölgesinin ölçekli bir taslağını hazırlayın. Öncelikle D yerleşimini doğrulamak için, yönlendirme amacıyla tüm dokuyu parlak alan aydınlatması altında görüntüleyin.Ardından floresan aydınlatma ile görüntüleyin. Posterior ekstra lateral nükleus difüz etiketleme göstermelidir. Sonrasında, yüksek büyütme altında, damarları referans noktası olarak kullanarak anterior ekstra lateral nükleusu bulun.Filamanlı, dış çapı 1 mm ve iç çapı 0,58 mm olan borosilikat kapiler cam kullanarak yüzeye yakın etiketlenmiş bir akson ararken alanı floresan ışıkla aydınlatın. Beş milimetre uzunluğunda dar bir şafta ve yaklaşık 1 ila 2,4 µm uç çapına sahip bir kayıt elektrodu çekin.Elektrodu filtrelenmiş hickman ringer çözeltisi ile doldurun. Nihai uç direnci 16 ile 155 mega ohm aralığında olmalıdır. Elektrodu, basınç portuna sahip bir elektrot tutucuya yerleştirin.Bunu, bir manipülatöre monte edilmiş olan kafa katına bağlayın. Ardından kafa katını bir amplifikatöre bağlayın. Görselde gösterilmeyen analogdan dijitale dönüştürücü bir veri toplama cihazı, amplifikatörü bilgisayara bağlar.Ardından, elektrot hattına 30 milibar pozitif basınç uygulayın. Elektrodu doku yüzeyinden aksona doğru yavaşça ilerletin. Elektrot aksona yaklaştığında, elektrot aksonun yanındayken pozitif basınç aksonun hafif ancak fark edilebilir bir şekilde hareket etmesine neden olmalıdır.Test stimülasyonları sunulurken aktiviteyi kaydedin. Elektriksel bir artefakt, kayıt ve stimülasyonun doğru gerçekleştiğini doğrulasa da, aksiyon potansiyeli görülmemelidir. Elektrottaki dışa doğru olan basıncı serbest bırakın ve stimülasyon ile kayıt işlemini tekrarlayın.Ardından, aksonun elektrodun içine girmesini sağlayacak hafif bir vakum uygulayın. Stimülasyon ve kayıt işlemini tekrar edin. Artık stimülasyonlara yanıt olarak bazı aksiyon potansiyelleri görmelisiniz.Aksiyon potansiyelleri görünür hale geldiğinde, basınç hattını kapatın. İstenen tüm kayıtlar tamamlandığında, balığın tamamen anestezi altında olduğundan emin olmak için tank suyunu litre başına 100 mg MS 2 22 içeren solunum çözeltisine geri döndürün. Balığı ötanize etmeden önce en az 10 dakika boyunca hiçbir EODC tespit edilmemelidir.Burada, 0.1 milisaniye süreli, santimetre başına altı milivoltluk, monofazik kontralateral pozitif transvers kare dalga pulse stimülasyonu ile uyarılan beş örnek iz (trace) aksiyon potansiyeli gösterilmektedir ve burada, aynı ünitenin sıfır zamanında santimetre başına altı milivoltlık stimülasyonlarla uyarılmasıyla elde edilen 75 milisaniyelik bir kayıt penceresinin 20 tekrarı sırasındaki spike zamanlarını gösteren bir raster grafiği yer almaktadır. Süre aralıkları sağda listelenmiştir. Burada, yanıtları stimülasyon tekrarı başına spike sayısı olarak nicelleştiren bir stimülasyon süresi ayarlama eğrisi (tuning curve) gösterilmektedir.Bu teknikte gösterilen cerrahi işlem ve boya enjeksiyonu, uygun şekilde uygulandığında uzmanlaşmış kişiler tarafından bir saat içinde tamamlanabilir ve kayıtlar boya enjeksiyonundan iki ila üç saat sonra başlatılabilir. Bu prosedürü uygularken, işlem sonrası deney hayvanının sağlık durumunun dikkatle izlenmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Daha derin beyin yapılarındaki nöronlardan kayıt almak için iki foton görüntüleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, tanımlanmış bir nöron popülasyonundan tekil ünite yanıtlarının nasıl etiketleneceği ve kaydedileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

retrograde-fluorescent-labeling-allows-for-targeted-extracellular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

Bu makale, tek tek hücrelerin sağlam fare retinada floresan etiketli nöron popülasyonları kayıt gösteriyor. Iki foton kızılötesi uyarma kullanarak transgenetically etiketli hücreleri ışık tepkileri, açık alan özellikleri, ve morfoloji çalışması için patch-klemp kayıt için hedef alındı.

Bozulmamış Retina Elektrofizyolojik Karakterizasyonu GFP-ifade eden hücre popülasyonlarının

Biz nöron veya polietilen emme pipet kullanarak herhangi bir nöronal yoluna floresan ve kalsiyum duyarlı boyalar yüksek konsantrasyon tanıtmak için basit ve düşük maliyetli tekniği tanımlandı.

Sinirler, yolları ve Floresan Boyalar ile Spinal Roots Retrograd Yükleniyor

Kaynak: İnal, M. A. et. al., Lipofilik Floresan Boyalar Kullanılarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronlarının Retrograd İzlemesi. J. Vis. Uzm.  (2020)Bu video, lipofilik boyalar kullanılarak Drosophila motor nöronlarının geriye dönük etiketleme yöntemini göstermektedir. Boya aksona girer, geriye doğru hareket eder ve nöronları yeşil olarak etiketleyerek morfolojilerinin ve projeksiyonlarının konfokal bir mikroskop altında ayrıntılı olarak görselleştirilmesini sağlar.

Floresan lipofilik boyalar kullanılarak Drosophila motor nöronlarının retrograd etiketlenmesi

Bir yöntem olup, önceden belirlenmiş neokorteks fonksiyonel mikro etki floresan boyalar ile nöronlar etiketleme için açıklanmıştır. İlk olarak, iç sinyal optik görüntüleme fonksiyonel bir harita elde etmek için kullanılır. Sonra iki foton mikroskopi haritanın bir mikro-etki alanı içindeki etiket ve resim nöronlar için kullanılır.

Belirli Fonksiyonel İçsel Sinyal birleştiren tarafından neokorteks Mikro-etki ve İki foton Görüntüleme nöronlar Hedefli Etiketleme

Bu protokol, uyanık sıçanlarda subkortikal beyin yapılarındaki nöronal aktiviteyi izlemek için bir kafa kısıtlama mekanizmasının tasarımını ve cerrahi implantasyonunu açıklar.  Juxtacellular konfigürasyondaki tek nöronları izole etmek ve anatomik konumlarını verimli bir şekilde tanımlamak için prosedürleri tanımlar.

Uyarı, Baş-ölçülü Sıçanların Alt-kortikal Beyin Yapıları içinde Juxtacellular İzleme ve Yerelleştirme Single Nöronlar

Biz bir in vitro hazırlık kullanarak beyin çekirdekleri içine anterograd veya retrograd tracer enjeksiyonları yoluyla nöronlar ve süreçlerini etiketlemek için bir teknik açıklar. Biz i n markalama doğruluğunu artırmak amacıyla bir avantaj floresan işaretli fare mutantları ve temel optik donanım alarak izleyici elektroporasyon vitro varolan yöntemi değiştirilebilir.

Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

Biz lipophilic floresan boyalar kullanarak Drosophila embriyonik motor nöronların retrograd izleme için bir yöntem açıklar.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

Burada, postnatal fare retinal eksplantlarında nörit morfogenezini hızlandırılmış konfokal mikroskopi ile araştırmak için bir yöntem sunuyoruz. Membran hedefli floresan proteinlerini Cre'e bağımlı bir şekilde eksprese eden rekombinant adeno ilişkili virüs vektörlerini kullanarak retina hücre tiplerinin ve ince süreçlerinin seyrek etiketlenmesi ve edinilmesi için bir yaklaşım tanımladık.

Genetik Olarak Hedeflenmiş Retinal Hücre Popülasyonlarının Seyrek Adeno İlişkili Virüs Etiketlemesi Kullanılarak Nöronal Arborizasyonun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Öğrenin retrograd floresan etiketleme ile canlı hayvanlarda belirli nöronlardan tek üniteli kayıt yapma yöntemini. Bu teknik, genetik olmayan sistemlerde hedeflenmiş hücre dışı kayıtlara olanak tanır.

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir

Daha fazla video keşfet