Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir In vivo

Bu prosedürün genel amacı, genetik olmayan bir model sistemdeki tanımlanmış bir nöron popülasyonundan in vivo tek ünite yanıtlarını kaydetmektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen beyin bölgesini açığa çıkarmak için bir kraniyotomi gerçekleştirilerek sağlanır. İkinci adım ise, hedef nöronların projeksiyon yaptığı bölgeye floresan boyayı yerleştirmek için tungsten tellerin kullanılmasıdır.

Ardından, boya retrograd olarak taşınır ve bu durum projeksiyon nöronlarının seçici olarak işaretlenmesiyle sonuçlanır. Son adım, tek bir projeksiyon nöronunun işaretli aksonundan kayıt yapmaktır. Nihayetinde, sağlam bir devre içindeki merkezi duyusal nöronların evo'daki duyusal uyarana nasıl tepki verdiğini göstermek için tek ünite hücre dışı kayıtlar kullanılır.

Bu yöntem, nöronal devrelerin sinaptik girdilerin zamanlamasındaki milisaniyenin altındaki farkları nasıl tespit ettiğine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tekil nöronları, hatta aksonları ve genetik olarak erişilemeyen sistemleri hedefleyebilme yeteneğidir. Zayıf elektrikli balıklar, iletişim ve navigasyon için elektrik sinyalleri kullanırlar.

Sinaptik girişlerin zamanlamasındaki milisaniyenin altındaki farkları kullanarak farklı balıklardan gelen sinyalleri ayırt ederler. Elektro-duyusal devrelerindeki varsayılan zaman karşılaştırıcı nöronların bu kadar küçük zamanlama farklarını nasıl tespit edebildiğini araştırdık. Ancak bu teknik, görsel ve işitsel duyusal yollar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Çevresindeki dokudaki küçük boyutlu yoğun kümelenme ve hücre gövdesinin çoğunu kaplayan presinaptik terminaller nedeniyle bu hücrelerden sıvı almak özellikle zordur. Tüm hücre kaydı sırasında hücre içi boya enjeksiyonu, o aksondan hedeflenmiş kayıtlar yapmak için tek bir hücreyi in vitro olarak etiketler. Benzer şekilde, hücre dışı boya enjeksiyonunu takiben gerçekleşen retrograd taşıma, yüzeysel beyin bölgelerindeki projeksiyon nöronlarının seçici olarak etiketlenmesi için bir araç sağlar.

Bu, in vivo tek ünite kayıtları için görsel rehberlik sağlamak amacıyla kullanılabilir. D kodlu iğneyi hazırlamak için, önce 160 mikrometre çapındaki bir tungsten teli, beş ila 50 mikrometrelik nihai iğne ucu çapına kadar elektrolitik olarak sivriltin. Ardından, deneyden bir önceki gece, genel anesteziyi indüklemek için iğne ucunu 10.000 moleküler ağırlıkta, Alexa fluor boyasıyla konjuge edilmiş iki milimolar dextran çözeltisi ile kodlayın.

Balığı, litre başına 300 miligram MS 2 22 çözeltisi içeren tank suyuna yerleştirin; dorsal vücut kas yapısına mililitrede üç miligram konsantrasyonda 100 mikrolitre flail enjekte ederek balığı immobilize edin ve elektriksel olarak susturun. Ardından, kayıt haznesini tank suyu ile doldurun ve balığı haznenin merkezindeki platforma ventral tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Daha sonra, ağzına bir pipet ucu yerleştirerek dakikada bir ila iki mililitre hızında, litre başına 100 miligram konsantrasyonda havalandırılmış MS 2 22 çözeltisi verin.

Ardından, balığı vücudunun her iki yanından sabit çubuklar ve balmumu ile sabitleyin. Oküler damarlardaki sürekli kan akışını ve normal vücut rengini kontrol ederek balığın sağlık durumunu izleyin. Daha sonra platformu dikey eksen boyunca döndürün.

Platformun bir ucunu, balığın başının dorsal yüzeyinin bir tarafı suyun üzerinde kalacak, vücudunun geri kalanı ise su altında kalacak şekilde ayarlayın. Kurumayı önlemek için derinin su altında kalmayan herhangi bir kısmına küçük bir parça Kim wipe yerleştirin. Bu işlemde, başın açıkta kalan yüzeyine bir kulak çubuğu yardımıyla %0,4 lidokain uygulayın.

Ardından, 6,2 santimetrelik bir balık için yaklaşık üç milimetreye beş milimetre boyutlarında dikdörtgen bir deri dokusu parçası kesmek üzere bir skalpel bıçağı kullanın. Dikdörtgenin lateral kenarı gözün merkeziyle hizalanmalıdır. Dikdörtgenin anterior kenarı gözün hemen posteriorunda, medial kenarı ise orta hattın hemen lateralinde olmalıdır.

Ardından, dikdörtgen parçayı bir penset yardımıyla çıkarın. Kafatasını açığa çıkarmak için ön taraftan 2,5 milimetrelik kare şeklinde ek bir kesi yapın. Skalpel bıçağını kullanarak fazla dokuları kazıyıp, kafatasının açığa çıkan yüzeyini tamamen temizleyin.

Ardından yüzeyi bir Kim wipe ve basınçlı hava ile tamamen kurulayın. Daha sonra, metal bir postu süper yapıştırıcı kullanarak anterior medial açık kafatası bölgesine yapıştırın. Yapıştırıcı tamamen kuruyana kadar bekleyin.

6,2 cm boyundaki bir balık için, kafatasında yaklaşık iki milimetreye dört milimetre boyutlarında bir dikdörtgen çizmek için 0,5 milimetre çapında küresel uçlu karbür freze içeren bir diş hekimi matkabı kullanın. Ardından, dikdörtgenin çevresini bistüri ve forseps ile kesin. Daha sonra kafatasını soyarak ayırın.

Beyni açığa çıkarmak için, yaylı bir makas veya bir iğne kullanarak hem pigmente dura mater'i hem de şeffaf pia mater'i kesin. Ardından, anterior ekstra lateral nukleus ve posterior ekstra lateral nukleus'u açığa çıkarmak için kesilen kısımları bir pensle uzaklaştırın. Şimdi, daha önce hazırlanan D kaplı bir iğneye sahip manipülatörü, ilgilenilen aksonları içeren hedef bölgenin üzerine konumlandırın.

Bizim durumumuzda, posterior ekstra lateral nukleusa iğne yaklaşık 25 µm derinliğinde dokuya hızla yerleştirilir. Boya 15 ila 30 saniye boyunca difüze olduktan sonra iğneyi geri çekin. Gerektiğinde işlemi ek taze iğnelerle tekrarlayın.

Boyanın hedef bölgeye tamamen yayılması için her birini farklı bir konuma yerleştirin. Ardından, boşluktaki fazla boyayı hickman's ringer solüsyonu ile durulayın ve boyanın alınması ile taşınması için en az iki saat bekleyin. İlgili aksonları görüntülemek için, içinde balık bulunan kayıt odasını, dik sabit tablalı bir epi floresan mikroskobun objektifinin altına yerleştirin.

Solunum çözeltisini taze tank suyuyla değiştirin ve aynı akış hızını koruyun. Ardından, toprak hattı telinin bir ucunu açıkta kalan beyin boşluğuna yerleştirin ve diğer ucunu kayıt kafa evresinin toprağına bağlayın. Sonrasında, kuyruk tabanının yanına bir çift kayıt elektrodu yerleştirin.

Ardından elektrotları bir diferansiyel amplifikatöre ve kayıt cihazına bağlayın. Elektrik organ boşalma komutunu (EODC) izlemek için, etiketlenmiş aksonların tam konumunu belirlemek amacıyla ana kan damarlarını nirengi noktaları olarak içeren, düşük büyütmede görüntülenen beyin bölgesinin ölçekli bir taslağını hazırlayın. Öncelikle D yerleşimini onaylamak için, yönlendirme amacıyla tüm dokuyu aydınlık alan aydınlatmasıyla görüntüleyin.

Ardından bunu floresan aydınlatma ile görüntüleyin. Posterior ekstralateral nukleusta yaygın etiketleme görülmelidir. Sonrasında, yüksek büyütme altında, damarları referans noktaları olarak kullanarak anterior ekstralateral nukleusu konumlandırın.

Yüzeye yakın etiketli bir akson ararken, bir milimetre dış çaplı ve 0,58 milimetre iç çaplı borosilikat kapiler cam ve filament kullanarak floresan ışıkla aydınlatın. Beş milimetre uzunluğunda dar bir gövdeye ve yaklaşık 1 ila 2,4 µm uç çapına sahip bir kayıt elektrodu çekin.

Elektrodu filtrelenmiş Hickman ringer çözeltisi ile doldurun. Nihai uç direnci 16 ile 155 mega ohm aralığında olmalıdır. Elektrodu, basınç portuna sahip bir elektrot tutucuya yerleştirin.

Bunu, bir manipülatöre monte edilmiş kafa aşamasına bağlayın. Ardından kafa aşamasını bir amplifikatöre bağlayın. Görülmeyen bir analogdan dijitale dönüştürücü veri toplama cihazı, amplifikatörü bilgisayara bağlar.

Ardından, elektrot hattına 30 millibar pozitif basınç uygulayın. Elektrodu doku yüzeyinden aksona doğru yavaşça ilerletin. Elektrot aksona yaklaştığında, elektrot aksonun yanındayken pozitif basınç aksonun hafif ancak fark edilebilir bir şekilde hareket etmesine neden olmalıdır.

Test stimülasyonları sunumu sırasında aktiviteyi kaydedin. Elektriksel bir artefakt, kaydın ve stimülasyonun doğru gerçekleştiğini teyit etse de, aksiyon potansiyeli görülmemelidir. Elektrot üzerindeki dış basıncı serbest bırakın ve stimülasyon ile kayıt işlemini tekrarlayın.

Ardından, aksonun elektrodun içine girmesini sağlayacak hafif bir vakum uygulayın. Stimülasyon ve kayıt işlemini tekrarlayın. Artık stimülasyonlara yanıt olarak bazı aksiyon potansiyelleri görmeniz gerekir.

Aksiyon potansiyelleri görünür hale geldiğinde, basınç hattını kapatın. Tüm istenen kayıtlar tamamlandığında, balığın tamamen anestezi altında olduğundan emin olmak için tank suyunu litre başına 100 mg MS 2 22 içeren respirasyon çözeltisine geri döndürün. Balığı ötanize etmeden önce en az 10 dakika boyunca hiçbir EODC tespit edilmemelidir.

Burada, 0.1 milisaniyelik, santimetre başına altı milivoltluk, monofazik kontralateral pozitif transvers kare dalga uyaran tarafından tetiklenen aksiyon potansiyellerini gösteren beş örnek iz bulunmaktadır; burada ise aynı birimin, sıfır zamanında santimetre başına altı milivoltluk uyaranlarla uyarıldığı 75 milisaniyelik bir kayıt penceresinin 20 tekrarı sırasındaki spike zamanlarını gösteren bir raster grafiği yer almaktadır. Sürelerin aralığı sağda listelenmiştir. Burada, yanıtları her uyaran tekrarı başına spike sayısı olarak nicelleştiren bir uyaran süresi ayarlanma eğrisi gösterilmiştir.

Bu teknikte gösterilen cerrahi işlem ve boya enjeksiyonu, düzgün şekilde uygulandığında uzmanlaşmış kişiler tarafından bir saat içinde tamamlanabilir ve kayıtlar boya enjeksiyonundan iki ila üç saat sonra başlatılabilir. Bu prosedür uygulanırken, işlem sonrası deney hayvanının sağlık durumunun dikkatle izlenmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Daha derin beyin yapılarındaki nöronlardan kayıt yapmak için iki foton görüntüleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, tanımlanmış bir nöron popülasyonundan tekil ünite yanıtlarının nasıl etiketleneceği ve kaydedileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.